国内双特异性抗体研发概述

普通单抗的2个Fab臂特异性相同，只能结合单一靶点，限制了其在某些领域的应用，如肿瘤、自身免疫疾病等需阻断多重信号通路避免代偿效应，对于病毒感染疾病由于病毒的高突变率常需要结合多抗原位点组织病毒逃逸，因此借助DNA重组和蛋白质工程技术手段构建的BsAb成为抗体药物新的研究方向之一。

BsAb具有同时结合2个不同表位的能力，能够起到特殊的生物学功能，如（1）免疫细胞的招募和激活，通过同时靶向肿瘤和免疫细胞达到召集免疫细胞清除肿瘤细胞的目的；（2）受体共刺激或抑制，利用BsAb拮抗2种或多种信号传导配体，避免逃逸机制从而改善治疗效果，如CTLA4-PD-1，VEGF-PDGF等；（3）促进蛋白复合物形成，如罗氏Emicizumab同时结合凝血级联酶促反应中的凝血因子IXa和凝血因子X，桥连FIXa与FX，促进FXa的产生；（4）多价病毒中和等方式等。

目前BsAb的临床开发主要集中于癌症和炎性疾病，主要作用机制是同时干涉病理生理过程的不同靶标，从而提高疗效。除了潜在的治疗性功效，BsAb在诊断领域也有广泛应用。

作为一项创造性设计的结果，BsAb可以以不同形式存在。大体分为两类：无Fc区域的小分子和IgG类型的Fc蛋白。很多例如串联单链抗体无Fc的BsAb采用了单链形式。每一个种类都有其优缺点。比如，小一些的无FcBsAb在结构上相对简单并有很好的实体瘤渗透速率，但他们通常有较短的血清半衰期；而IgG类BsAb尽管在肿瘤渗透方面表现不那么有效，但有更长的半衰期并可以支持二级免疫功能。

根据不同结构可将BsAb分为2大类：含Fc片段的BsAb（IgG-likeBsAb）与不含Fc片段的BsAb（non-IgG-likeBsAb）。

IgG-likeBsAb：IgG样BsAb有Fc部分，具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（ADCP）。分子量相对较大，其Fc部分有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性。IgG样BsAb相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期。此类抗体结构主要包括Triomabs/quadroma、DVD-Ig（dualvariable domain Ig）、CrossMAb、Two-in-oneIgG、scFv2-Fc。

non-IgG-likeBsAb：非IgG样BsAb缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点。因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。这些BsAb有诸多形式，主要包括TandAb（tandemdiabody）、scFv-HSA-scFv、BiTE（bi-specificT-cell engager）、DART（dualaffinity retargeting）、Nanobody。

BsAb与普通抗体相比增加了一个特异性抗原结合位点，在治疗方面表现出了以下优势：

介导免疫细胞对肿瘤的杀伤：BsAb的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，BsAb有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。目前已经批准上市的2个双特异性抗体产品都属于这个类别，TrionPharma公司开发的catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，而Micromet公司和Amgen公司开发的Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。

   双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药：同时结合双靶点，阻断双信号通路是BsAb的另一个重要作用机制。受体络氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTKs）是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用，如Her家族等。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对RTKs的单靶点单抗已在肿瘤治疗中得到广泛应用，但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用BsAb药物同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果；

   具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性：利用BsAb两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合癌细胞表面2种抗原，可以有效增强抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用；

有效降低治疗成本：以BiTE为例，与传统抗体相比在组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率、脱靶率和临床适应症等指标方面都具有较强的竞争力，临床优势显著。特别在使用剂量方面，由于其治疗效果可以达到普通抗体的100-1000倍，使用剂量最低可降为原来的1/2000，显著降低药物治疗成本。相对于组合疗法，BsAb的成本也远远低于两个单药联合治疗。

随着生命科学基础与应用研究的飞速发展，BsAb的分子模式与制备技术也在不断的演进，目前已发展出30多种BsAb技术平台，国际主流的BsAb技术平台包括DVD-Ig（艾伯维）、CrossMab（罗氏）、Duobody（GenMab）等。国内企业中，拥有BsAb技术平台的企业有友芝友的Ybody、岸迈生物的FIT-lg、键能隆的iTAB、康宁杰瑞CRIB技术平台等。

CRIB：ChargeRepulsion ImprovedBispecific是康宁杰瑞自主研发的BsAb平台，基于完整的抗体框架结构，通过有针对性的调整不同Fc链之间的电荷网络分布，大大增加异二聚体形成的几率的同时，阻碍同二聚体的形成，从而达到构建BsAb分子的目的。

FIT-Ig：是一项新型的构建BsAb的技术平台，保留了单克隆抗体的主要基本结构元素及生物学特性，同时可以结合及抑制两种不同的致病因子(靶源)，并且该项技术已经通过了对产品的可药性和产业化规模生产的验证。

iTAB：(ImmunotherapyAntibodies)，双特异性抗体分子通过与肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞抗原CD3同时发生结合，将T细胞定向于肿瘤细胞，两者之间形成突触，触发T细胞活化，进而引发肿瘤细胞溶胞机制，造成肿瘤细胞死亡。值得注意的是，健能隆和友芝友双抗技术平台均参考安进公司的Blincyto。

ALLIGATOR-GOLD®平台：RUBY BsAb由通过C末端重链与Fab结构域融合的免疫球蛋白组成。Fab结构域通过其轻链连接。RUBY是一种新型的IgG类双特异性抗体形式，可以从任何两种抗体中即插即用生成双特异性化合物，具有出色的稳定性和可制造性。此外，RUBY可以以类似于天然抗体 – 抗原相互作用的方式与两个靶标（具有二价相互作用）无限制地双重结合。该平台是具有专利的人类抗体库，其中含有超过600亿个独特的抗体片段（也称为“scFv”）。从该抗体文库中，可以开发针对任何靶分子的候选药物。ALLIGATOR-GOLD®中的各个抗体片段在六个高变区中具有不同的特异性序列，其构成与靶分子结合的抗体表面。scFv序列的其余部分在文库中的所有抗体中是相同的，并且被选择以实现稳定性和可制造性的最佳性质。ALLIGATOR-GOLD®旨在模拟和超越天然人体抗体的变异性。

ALLIGATOR-FIND®平台：是优化抗体和其他蛋白质的分子进化技术。FIND®用于进一步优化从ALLIGATOR-GOLD®中鉴定的抗体。该技术可以快速产生大量功能性抗体变体。从这些变体中，可以选择出具有优化特性的抗体。FIND®技术几乎可用于改变抗体的任何特性。可以改善功效、效力、药代动力学、安全性和降低抗原性，显示出显著的临床益处。公司已开发的ADC-1013和ATOR-1015采FIND®技术开发而成。

BsAb的制备主要有化学偶联，双杂交瘤细胞法，重组基因制备等方法。化学偶联法和双杂交瘤融合法生产出的BsAb为鼠源性，具有较强的免疫原性，且产量低纯度差，在临床应用上有很大的制约，重组DNA技术是目前制备BsAb使用最多的技术。

   化学偶联法：该方法最早出现于上世纪80年代，其原理是通过化学偶联剂（如邻苯二马来酰亚胺、N-琥珀酰-3-（2-吡啶二硫基）丙酸盐、二硫代酰基苯甲酸等）将两个完整IgG或两个F(ab)2抗体片段偶联成一种BsAb，这种方法快速简便，但是容易破坏抗原结合部位从而影响抗体活性，同时交联剂本身的安全性和致癌性不确定。

双杂交瘤融合法：通过细胞融合的方法将2株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。由于双杂交瘤的遗传背景来源于亲代的两种杂交瘤细胞，它必然要产生2种重链和2种轻链分子，而这些轻重链的随机组合配对方式才能产生所需的BsAb。利用双杂交瘤方法制备BsAb随机性较大，效率低，但是BsAb生物活性较好，抗体结构比较稳定。利用Konck-in-hole技术可以有效解决异源抗体重链正确配对的难题。制备方法是将一个抗体的重链CH3区366位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的络氨酸，形成突出的“杵”型结构；将另一个抗体重链CH3区407位较大的络氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“臼”型结构；利用“杵臼”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。

重组基因：利用基因工程技术制备BsAb是目前最常用的制备方法，其制备原理为利用基因工程技术对传统抗体进行基因工程方面的改造，从而形成多种形式的双特性抗体。

长久以来，IgG类BsAb是通过两个不同的单抗的化学共轭以及杂交瘤技术来获得的。然而第一种方法的同质性和稳定性较低。第二种方法中，两个预先建立好的杂交瘤融合后产生一个可以表达两个母体重链和轻链的细胞。这个方法最大的限制是希望获得的BsAb只体现了生成的免疫球蛋白的一小部分，这是由于同质化重链的优先结合以及重链轻链的无效结合。曾经有一项获得较好治疗效果的临床研究由于没有获得足够量的目的BsAb而无奈过早地关闭。近期，人们开始采用哺乳动物细胞系通过重组DNA方式生产BsAb。而问题还是一样，无意义的组装带来了副产物（如重链同源二聚化和非同源的重链轻链配对）。这不仅导致低产量并给纯化带来了极大挑战。

5.1 强制重链异源二聚化和同源重链轻链配对的策略：

四个不同多肽链（分别来自两个母体抗体的重链和轻链）随机组装可能带来10种不同产物，其中只有一种是想要的BsAb。KiH和Crossmab两种技术已经分别提升了重链异源二聚化和同源重链轻链配对。在KiH方法中，非对称疏水变异被引入同源CH3区域（例如，一个CH3区域较小的氨基酸被一个较大的氨基酸替代 ，形成Knobs而另外一个CH3区域的较大氨基酸被一个较小氨基酸替代，形成hole）的表面。这个工程和Fc变异更容易异源二聚化而不是同源二聚化。在Crossmab技术中，一个BsAb的Fab手臂通过交换重链和轻链的区域而被修饰，另一条手臂保持不变。修饰后的轻链具有部分同源重链，不再会与非同源重链结合，因此保证配对的正确性。

除此之外，人们还开发出一些方法促进组装。通过引入CH3表面的系统化修饰以此阻拦同源重链结合同时促进异源重链的相互作用可以促进异源二聚化。例如，在cFAE方法中，将匹配的变异引入到两个母体抗体CH3区域表面，减弱了非共价CH3-CH3结合并导致在温和条件下同源二聚体的解聚。同时，这种变异在结合点再氧化的时候极大地提升了重链异源二聚化。用这种方法可以用各自表达的母体Mab获得超过90%异源二聚体。重链异源二聚体同样可以通过electrostaticsteering，SEED，energyguided pairing, leucinezipper和CH3同源二聚体表面与异源二聚体表面的替代来获得。最终，重链配对问题可以通过建立共同的重链BsAb来避免。这种BsAb的特异性是由两个不同轻链诱导的。

为获取重链轻链间的选择性配对，lewis等将KiH技术拓展到Fab区域并通过引入补余变异生成了一个重链和轻链成直角的表面。遵循同样的策略，Dillon等通过计算机设计创造了一个重链轻链成直角的配对。另一研究小组通过在一个Fab手臂中用工程化的二硫化键替代天然交叉二硫化键同时又在另一条arm中保留了野生型的二硫化键赋予了重链轻链配对。凭借两个分别表达并纯化的母体单抗创造出全链BsAb，上文提到的cFAE方法同样避免了轻链错配问题。最近，有一种方法通过分裂内含子调节的蛋白转录，组装两个分别生成的母体抗体片段，避免了重链轻链错配。重链轻链的错配也可以通过利用一个配对两个重链的共同的轻链来进行包围。然而，对已知BsAb的这个共同轻链的识别十分耗时，且往往得不到想要的结果。最后，重链轻链错配也可以用scFV,单链抗体或Vl-HC融合作为一个或两个BsAb手臂的方式来避免。

尽管这些努力显著减少不想要的副产物，BsAb的生产仍伴随着大量的目的物类似的杂质，这些杂质来源于残留重链同源二聚体和不完全组装，不同链的不一致表达。一个同时包围重链同源二聚体，重链轻链错配并减少不完全组装的策略是采用相当的对称形式，这种形式只引入两个特异性肽链，双特异性是通过附上一个带有新的抗原结合重链或轻链区域来获得的。然而，一些情况下，具有这种设计的BsAb不稳定且易形成聚体。以IgG-scFV融合为例，分子内和分子间区域分别交换可以形成变体和聚体。大体上，BsAb生产中的副产物通常包括同源二聚体，缺少一条轻链的抗体，半抗体，重链聚合物，轻链聚合物，游离重链和轻链。这些副产物在标准单抗生产中不常见，由于通常的单抗纯化策略中缺少对他们的去除，所以他们的出现对下游工艺提出很高的挑战（如蛋白A层析无法将BsAb从包含Fc的副产物中分离）。另外，在通过延展链获得的BsAb中具有较高含量的聚体

同源二聚体:尽管KiH技术显著提高了异源二聚化的生成，同源二聚化仍不能完全被消除。在knob变体中的同源二聚化不易被发现，在Hole变体中的同源二聚化仍有发生。Hole-hole的二聚体占整体量的5%。另外，良好的异源二聚化产量要求两条重链的平等表达。在KiH中，如果hole链过度表达，同源二聚体的含量会明显增加。KiH以外的促进异源二聚体的策略也无法抑制同源二聚体。在所有产品相关的杂质中，同源二聚体是最难去除的一类因为他们与目的BsAb具有相似的理化特性。很明显，常用在捕获阶段的蛋白A层析无法将他们与目的BsAb区分开。目前开发出很多方法帮助清除这类杂质，下面部分将介绍未修饰、工程化以及共用重链双抗的同源二聚体去除方法。

未修饰BsAb：对于母体抗体在等电点或疏水性上有较大差异的这类BsAb，他们与同源二聚体副产物的分离可以用常见的离子交换，疏水交换和羟基磷灰石。由于每一个这种BsAb的单价部分对应于母体单抗的一半，这种BsAb的净电荷疏水性处在那些对应的母体抗体之间。在已知的案例中，通过筛选以上提及的树脂可以选择出一种可接受的分离方法。每种树脂的适宜的离子或pH梯度需要仔细筛选以保证最好的分离效果。在理想的案例中可以得到三种峰：两个母体单抗峰中间夹着BsAb峰。Sharkey等最近报道了以梯度洗脱的离子交换从同源二聚体中纯化共同轻链BsAb的异源二聚体的方法，并证实用高度线性pH梯度可以得到足够的分离度，即便两种母体单抗的pI非常接近。作者证明pH梯度相对于盐梯度有较高的分辨率。对于一个已知BsAb，阳离子交换或许比阴离子交换有更好的分离，反之亦然。好的分辨率不仅得益于小粒径树脂，更取决于生产规模的，粒径在30-90um的树脂，本研究采用了K&H等人描述的缓冲液体系，这个体系保证较宽范围内良好的pH梯度控制。与这些结果一样，Hall等人最近证实在接近蛋白等电点附近的碱性pH的阳离子交换有效去除了带有错配二硫化键的BsAb变体，表明离子交换对于分离结构和特性相近的蛋白方面的能力。有报道使用亲硫亲和层析分离从单特异性物种杂交瘤产生的BsAb。但这种方法对于从两个相同种属或亚种生产出来的单抗产生的BsAb纯化不一定有效，这是因为分离依靠在每个杂交异源二聚体的重链半胱氨酸残基的不重合。

在很多情况下，尽管上述层析方法具有一定的分辨率，从单特异性同源二聚体中分离BsAb通常都是很难的。因此，需要在产率和纯度间进行权衡，一般都以牺牲产率为最终结果。Muller等人最近报道了这种权衡可以通过应用双柱反向阳离子层析来解决。多柱反向梯度纯化MCSGP是一种可以从多组分混合物中分离单一种属连续流工艺的高收率方法。在单一层析柱批次中，中间洗脱BsAb峰可能与旁边的同源二聚体峰重叠，而侧峰部分的BsAb由于纯度不够而被舍弃。有了MCSGP，在一根柱子中纯化的BsAb片段也能够在下一根柱子中得到回收。这种多步循环可以最大化产率。MCSGP工艺无需牺牲产率而完全去除接近洗脱条件时的同源二聚体。

最近，有人新发明了一种BsAb独特型纯化工艺，这种工艺将BsAb与天然IgG有效分离。这种工艺生成了两个各自特异性识别母体抗体的VHH片段，并被用做连续流纯化中的亲和配基。由于抗独特型VHH只识别恰当匹配的重链-轻链对，两个同源二聚体连同其他杂质被留在两端流穿的组分中。因此，尽管有同源二聚体和其他污染物，带有正确重链-轻链对的BsAb仍能通过这种双亲和工艺纯化出来。亲和工艺中，可以用低pH洗脱结合抗体。15kDa大小的VHH片段具有良好的物理稳定性和极度折叠特性，以此为基础的亲和模式可以再生超过2000次且不损失载量。

工程化BsAb：

等电点工程化双抗：对于两个母体单抗等电点相近的情况，将一个重链的等电点工程化可以扩大两个单抗等电点的差异，进而用离子交换方法纯化目的BsAb。原本拥有特异性等电点低的不同亚属的不变区可以被用来作为构成BsAb的两条重链的不变区。大体来说，两个母体单抗等电点相差0.5以上就可以使用离子交换层析。

亲和工程化双抗：除了工程化等电点，一条重链Fc的蛋白A结合活性也可以修饰用于BsAb亲和纯化。众所周知，人IgG3同形不结合蛋白A。因此，可以用这两种方法：用从人IgG3生成的重链代替一条Fc链或在一个CH3区域用从IgG3对应的残基代替对蛋白A结合十分重要的残基来形成蛋白A结合差异。消除了蛋白A结合能力的Fc区域被称为Fc*。蛋白A结合能力切除的后果是，相比于FcFc和Fc*Fc*重链同源二聚体，带有Fc和Fc*结构的BsAb具有蛋白A亲和媒介作用，它的结合活性被减弱处于正常。

这种创造出来的亲和层级使得目的BsAb从同源二聚体杂质中亲和纯化出来。当混合物载到缺少VH3结合能力的蛋白A层析柱后，Fc*Fc*同源二聚体呈现流穿模式而BsAb和FcFc同源二聚体结合到层析柱上。通过较弱的pHBsAb被洗脱下来，而在此pH下FcFc仍结合在柱子上。某些情况下，一些传统，能结合Fc区域和VH3区域IgG的蛋白A填料的分辨率表现不是很好。这种VH3交叉结不仅源自于Fc*Fc*同源二聚体保留，更能说明与Fc区域特性无关的抗体的洗脱pH导致了BsAb和FcFc同源二聚体间较差的分辨率。此类问题可以通过用特异性缺少VH3区域结合能力的工程化蛋白A配基解决。据了解，在促溶性盐溶液作为洗脱缓冲体系的流动相改良剂时，即使有VH3结合的存在下，BsAb和FcFc同源二聚体的分辨率也可以大大提高。通过抗体和蛋白A配基间的疏水作用的调节，可以提高分辨率。

如前文所说，双特异性是源自于两个不同轻链。在这个研究中，用一条重链和两条轻链组装成BsAb，这种BsAb称为κλ-body。除了目的BsAb，三条链（重链，k轻链和λ轻链）共表达时有更多的k和λ同源二聚体生成。这个κλ-body的特点衍生出了常规，稳健的纯化工艺。这个工艺包括三步亲和，接连使用mabselect sure, kappa select和lambdaFabselect介质。第一个是常规蛋白A介质，通过流穿模式，结合抗体的Fc段而将杂质和游离轻链留。第二步和第三步分别结合k轻链和λ轻链的不变区。因此，双特异性和单特异性抗体都结合到mabselect sure，更多的k和λ的同源二聚体通过kappa和lambdaselect的流穿模式被去除掉，最终产物得到了。

KappaSelect and Lambda FabSelect的顺序是可以调换的，这取决于两个单特异性品种的相对量。建议把占主要量的单特异性品种先去除，这样可以把载量发挥到极致。同样可以结合kappa轻链的蛋白L介质可以作为kappaselect的替代。另外，蛋白A去除了可以被后续步骤去除的主要杂质，可以将它省略或在结尾用非亲和精纯层析来替代，具体要取决于杂质含量，这么做是为了减少整体成本。这么做的另一个好处就是避免了亲和层析作为最后一根柱子并可以去除脱落的亲和配基。近期Fouque等报道了用疏水和复合模式填料从单特异性κ和λ抗体中分离BsAbκλ-body。这一工作给纯化提供了新的选择，使得κλ-body纯化不一定依靠轻链亲和介质。

Halfand ¾antibodies：是BsAb生产中两种常见的副产物，尽管他们不一定同时出现。Bertal等人报道了HA层析蛋白A后的结合-洗脱模式将BsAb从Halfand ¾antibodies中纯花出来的案例。在线性盐梯度下，half antibody比BsAb较早洗脱出来。在一个案例中，BsAb的纯度从33%提高到80%。另外一个案例中，BsAb纯度从77%提高到97%。对于¾antibodies，可以与BsAb在一个单峰中相似条件下同时洗脱下来，但较集中在峰尾部分。主峰部分含95%的BsAb和1.8% ¾antibodies。相比于载量的价值，这是一个很大的提升。出来线性梯度，阶段盐浓度也可以将BsAb从两种副产物中分离出来。根据Gagnon等的报道，包括5-10%的作为流动相的PEG，在梯度起始和结束的缓冲液大大提高了HA分辨率，并且得到了更完全的分离。Kluter等最近证明在带有PEG作为流动相的线性pH梯度阳离子交换可以有效将¾antibodies从相应BsAb中分离。由于Halfantibodies只含有一个Fc区域，它和蛋白A介质的结合要弱于含有全Fc区域的BsAb。因此，Halfantibodies可以用在线性pH梯度下的蛋白A介质来去除。如早期所描述，介质的选择性可以通过降低抗体和蛋白A配基间疏水作用的促溶性盐来提高。除了HA和蛋白A层析柱，疏水作用也证明可以有效将BsAb从Halfantibodies分离出来。

scFv-Fc 融合：如上所述，重链的异源二聚体已经通过用在α和βT细胞感受器不变区替换CH3区域之间的蛋白表面得到了升级。这种设计在收获时获得了超过90%的异源二聚体。在一些案例中，用这一平台制备的BsAb形成了Fab*scFv的形式来避免重链-轻链错配。这种设计中需要三条链的共表达。在制备这种Fab*scFv形式的BsAb中，scFv-Fc可能过表达而变成污染物。它可能还无法用常规蛋白A层析来与目的BsAb分离。然而，特异性结合kappa轻链的kappaselect亲和介质提供了有效的分离方式。缺少轻链不变区的scFv-Fc将会流穿而BsAb会结合。这一方法同样可以适用于scFv-Fc同源二聚体，两个潜在的单特异性污染物之一的去除。值得注意的是，蛋白L介质结合到可变区而不是不变区，因此无法将scFv-Fc与BsAb区分开来。

重链和轻链：重链和轻链也是BsAb生产中两种常见的副产物。经大部分轻链在蛋白A层析中被流穿出去，仍有小部分可以非特异性结合或与目的蛋白共同洗脱下来。大体上讲，重链和轻链以其理化特性明显不同于BsAb这一特点，相比于其他杂质是比较好去除的。例如，大多数轻链的等电点在4.6-6.7，而对应的BsAb在6.5-9.0.在合适条件下，离子交换，疏水以及复合模式填料都可以去除重链和轻链。另外，重链可以通过特异性结合轻链的亲和层析来去除。可以看到，有时一部分目的BsAb会通过非共价键与一些轻链很强烈地结合。在这些情况下，首先需要破坏轻链与BsAb的这种链接然后再去除轻链或与之连接的BsAb。

聚体：如之前提到的，通过链的扩展获得特异性的BsAb很容易形成聚体。有时候聚体含量高达50%，因此对这种BsAb，聚体的去除成为下游工艺的主要任务。疏水和HA层析是两个广泛应用去除聚体的方法。疏水采用单体蛋白流穿而疏水性聚体结合这种流穿模式达到分离效果。HA层析则相反，采用结合-洗脱模式。超过60%的聚体可以降低到0.1%以下。PEG提高了蛋白保留性，其提高的程度与蛋白大小成比例。这说明PEG存在的情况下，相较于单体，聚体的保留时间也会大大增加，由此把两种成分分离开。如之前报道，在5.625%PEG含量下聚体可以达到基线分离。除了HA，其他复合模式介质也有聚体去除的良好效果。例如，captoadhere和captoMMC impres这两种GE的复合模式介质表明了良好的聚体去除效果。特别是CaptoMMC impres是一种以captoMMC为基架，配以小粒径和减少的配基密度，是专为增加聚体去除能力设计开发的。在两份报道中，captoMMC impres分别将聚体含量从2.4%和5.0%降低到0.5%和0.6%。

尽管本文提到的层析方法对不同聚集体和副产物展现了良好的去除潜力，解决BsAb特异性问题不应完全依靠下游工艺。相反应该在各个阶段进行优化降低下游压力。促进目标物配对的不同结合的连续流工程化可以在已有方法后加以进一步讨论。这类工作可以减少副产物的种类和含量，同时促进目的BsAb的分离。例如Skergro等通过结合重链异源二聚体促进技术和不对称蛋白A结合策略获得了高达90-95%产率的异源二聚体以及强效的同源二聚体效果。对于具有延展链的BsAb，应采用修饰和优化减少分子聚合趋势。在IgG-scFV案例中，用VH-VL交叉二硫化键来稳定scFV位点显著地降低了聚集体的含量。甚至调节IgG和scFV连接键的长度也可以降低聚集体。交叉二硫化键和合适的链长度都可以促进scFV自折叠并减少通过区位交换带来的二聚体现象。

除了连续化工程，平衡各个个体链中的表达也对良好的BsAb产率有重要意义，因为无规则链表达会带来副产物增加以及降低正确组装的BsAb。相较于常规单抗生成，应多筛选增加的矢量结构，血清含量，微量混合和培养条件来保证低污染物的高效生产。即使连续化工程和优化表达，副产物仍不能完全去除，不同的细胞库有各种不同的杂质情况。因此建议结合其他参数，从不同细胞库中分离BsAb的相对难点需要仔细评估并认真考虑以获得最佳细胞库的建立。谨记副产物种类的减少不一定意味着纯化工作难度的降低。整体难度取决于每一个单一种类的杂质。特别地，如果一个副产物有可能结合BsAb，它可以对纯化造成很大挑战。基于这种复杂情况，需要用小规模纯化评估纯化BsAb的难度。由于亲和层析通常无法将目的BsAb从众多杂质中分离，可以采取其他层析方法。纯化的难度也可以作为筛选细胞库的衡量指标。即使表达量再高的细胞库也要面对纯化的挑战的考量。

截至2018年上半年，全球已有84个抗体药物上市，2017年全球抗体药物年销售额已超千亿美元，抗体药物已成为现代生物制药行业中占比最大、增长最快的子行业。

7.1已上市BsAb药物

目前，全球已有3个BsAb药物上市。

Catumaxomab（卡妥索单抗）是全球首个获批的BsAb药物药物，一种抗CD3和上皮细胞粘附分子(EPCAM)的小鼠BsAb药物，于2009年被EMA批准上市，用于恶性腹腔积液的治疗。在II/III期研究中改善了无穿刺存活率和下次腹腔穿刺的中位时间，减少了腹水的体征和症状，并显示出改善OS的趋势。最常见的不良反应是发热，恶心，呕吐和腹痛。目前正在进行的临床试验包括卵巢癌、胃癌和上皮癌。不过Catumaxomab目前并未获得FDA批准。Catumaxomab是一个分子量在150kDa三功能的抗体，由一个靶向肿瘤EpCAM的小鼠IgG2a和一个靶向CD3ε的大鼠IgG2b构成，同时还能通过Fcγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、星状细胞以及NK细胞。由于小鼠和大鼠的轻重链之间很少发生错配，通过quadroma（hybrid-hybridoma）的方式，将分别表达小鼠和大鼠抗体的杂交瘤进行二次融合，从而得到同时分泌Triomab双特异性抗体以及小鼠和大鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后在通过亲和力纯化的方式、分别去除小鼠和大鼠单克隆抗体。虽然Catumaxomab是第一个批准上市的双特异性抗体，但同时也具有非常明显的局限性，主要体现在Triomab抗体复杂的生产工艺以及异源抗体比较容易产生的免疫原性问题。

Blinatumomab（博纳吐单抗）于2014年被FDA批准上市，由Micromet公司（后被Amgen公司收购）开发，是一种BiTE（双特异性T细胞衔接系统）抗体药物，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。相比化疗药物，Blinatumomab将复发性或难治性前体B细胞ALL中位生存时间延长了近一倍（7.7个月VS4个月），2017年其销售额为1.75亿美元。Blinatumomab是利用DNA重组技术制备的一种双特异性的单链抗体BiTE，通过一条多肽链靶向肿瘤细胞和T细胞表面抗原的两种单克隆抗体的可变区连接起来，Blinatumomab选择性地靶向B细胞表面抗原CD19，同时特异性地结合T细胞表面抗原CD3从而激活T细胞。因为主要由两条单链抗体连接而成，BiTE的分子量较小（55-60kDa），容易渗透肿瘤组织。同时BiTE缺乏Fc段因而免疫源性较低。临床试验已经证明Blinatumomab即便在很低的使用剂量下，依然可以有效召集T细胞并清除肿瘤，显着改善复发或难治性B细胞前体ALL患者的中位OS。其常见的不良反应包括发热，头痛，发热性中性粒细胞减少和外周性水肿。但是由于没有Fc片段，BiTE抗体分子的体内半衰期很短，试剂使用的时候需要额外配备连续输液装置。

Emicizumab在2017年11月被FDA批准上市，用于A型血友病的治疗。Emicizumab部分模拟了FVIII的功能，通过桥连FIXa与FX，促进FXa的产生，该药物的上市，打破了A型血友病此前只能采用VIII因子替代疗法的治疗现状。Emicizumab此前曾获突破性药物、孤儿药和优先审批资格，专家预测峰值销售可达50亿美元。

7.2国内公司

BsAb是一个新兴的研发细分领域，被视为是肿瘤治疗的一种新策略，极具前景。在全球，该领域的药物开发非常热门，包括罗氏、辉瑞、安进在内的跨国药企多有布局。紧跟国际研发脚步，国内诸多研发公司近年来开始布局这一领域。据不完全统计，国内目前从事BsAb研发的企业共有19家，其中上市公司3家，分别为珠海丽珠、江苏恒瑞、浙江海正药业，非上市公司16家，分别为武汉友芝友（石药占股40%）、武汉中美华世通、苏州康宁杰瑞、苏州信达、苏州天演药业、苏州博生吉（安科生物占股20%）、上海君实生物、上海复宏汉霖（复星医药子公司）、上海岸迈生物、上海健能隆（合肥亿帆子公司）、上海宜明昂科、北京康众生物、北京天广实、深圳本康生物、中山康方生物、杭州特瑞思。

武汉友芝友：友芝友拥有自主开发的BsAb技术平台YBODY®。采用YBODY®结构的抗体一端能够结合肿瘤细胞表面蛋白，另一端能够结合T细胞CD3分子，与CD3的结合能够激活T细胞，并将T细胞靶向肿瘤细胞，增强杀伤效果。另外，YBODY®也能根据功能需求做成其他形式：如肿瘤细胞的两个靶点，或者一个肿瘤细胞靶点一个用以靶向细胞与药物的位点。目前友芝友已有两款产品进入CDE——注射用重组抗HER2和CD3人源化BsAb（2017年9月29日，M802）、注射用重组抗EpCAM和CD3人鼠嵌合BsAb（2018年3月6日，M701）。其中注射用重组抗HER2和CD3人源化BsAb是国内首个获得BsAb临床批件的项目，目前正处于临床I期，拟用于治疗HER2表达的转移性乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤。注射用重组抗EpCAM和CD3人鼠嵌合BsAb是友芝友第二个申报临床的双抗项目，主要针对EpCAM表达阳性结直肠癌和卵巢癌等恶性腹水患者。另外，公司抗PD-L1和CD3的人源化BsAb正处于临床前研究阶段。

武汉中美华世通：中美华世通成立于2009年，由“国家千人计划”专家张发明博士回国创立。其子公司杭州翰思生物致力于肿瘤免疫领域生物大分子的研发及产业化，自主研发的PD-1目前已在进入国内二期临床。临床前品种围绕PD-1布局多个BsAb，包括PD-1/CD47,PD-1/IL-10,PD-1/VEGF,CD47/VEGF等，其中PD-1/CD47（HX009）目前已完成中试，正在猴子体内进行长毒试验，预计明年中获得临床批件。

苏州康宁杰瑞：目前康宁杰瑞的研发的“注射用重组人源化抗HER2BsAb”已于2018年4月10日获得临床批件，2018年10月，康宁杰瑞宣布其全球首创重组人源化PD-L1–CTLA-4BsAbKN046已经在澳大利亚开展1期临床，并获得中国国家药监局的临床批件。几日后，该公司又宣布HER2BsAbKN026的临床试验申请已获得美国FDA批准，同时宣布KN026在中国的临床试验已顺利完成了第一例病人的给药。目前康宁杰瑞与肿瘤治疗专家紧密合作，针对HER2过表达的乳腺癌、胃癌和肺癌等患者开展多个临床试验。另外还有多个BsAb处于临床前研究。

苏州信达生物：在BsAb领域，信达生物与岸迈生物、礼来达成合作协议，获得岸迈生物的FIT-Ig平台技术的全球权益。IBI302是信达生物基于岸迈生物的FIT-Ig平台技术开发的一款双靶点单克隆抗体注射液。IBI302以血管内皮生长因子（VEGF）和C3b、C4b为靶点，同时结合VEGF和补体两个靶点，阻断VEGF信号通路和补体活化，从而抑制病变新生血管生长。目前信达生物正在开发其用于年龄相关性黄斑变性的研究，目前已进入临床1期。

苏州天演药业：天演药业成立于2012年，致力于开发新一代治疗性和诊断用抗体技术的生物制药公司。公司的药物筛选平台“动态高精度抗体技术”突破了生物抗体药物研发面临的两大瓶颈：如何扩展治疗性抗体的靶向空间和如何提高抗体药物开发的成药性。目前，天演药业已经建立了高质量的、多样性达千亿的可开发性抗体库，能精准地设计、构建及筛选治疗性抗体，并能生成针对不同靶点的单特异性与双特异性抗体，包括传统上难以生成抗体的复杂靶点的但特异性及双特异型抗体产品线。

苏州博生吉：博生吉医药以肿瘤细胞免疫治疗技术与产品为主要发展目标、以临床技术服务为主要业务的高科技企业。博生吉以细胞疗法为主，但在BsAb方面也崭露头角，公司研发的针对多发性骨髓瘤的CD3/CD138BiTE在细胞水平上展现了骨髓瘤细胞的杀伤作用。

上海君实生物：君实生物是一家以开发治疗性抗体为主的研发型高科技公司，专注于创新单克隆抗体药物和其他治疗性蛋白药物的研发与产业化，已搭建国内一流创新人源化抗体药物产品研究开发技术平台。该平台涵盖分子抗体药物筛选、高产稳定CHO细胞株的构建及治疗性抗体分析检测在内的多个核心技术。公司旗下目前在研的BsAb候选药物主要有两款：创新性人源化JS005BsAb注射液、创新型人源化JS003BsAb注射剂。

上海复宏汉霖：复宏汉霖由复星医药与美国科学家团队于2009年12月合资组建，公司主要致力于应用前沿技术进行单克隆抗体生物类似药、生物改良药以及创新单抗的研发及产业化。目前，复宏汉霖有14个单抗药物处于在研阶段，其中BsAb药物两个（HLX31、HLX32）。

上海岸迈生物：成立于2016年，主要关注肿瘤领域的BsAb研发。核心技术是BsAb研发平台FIT-lg，目前公司正全力将现有产品向临床推进。针对多种实体瘤适应症的EMB01已于2018年底先后获得美国FDA和中国国家药品监督管理局的IND批准，开始开展临床1/2期的临床研究。EMB01是一款针对EGFR和c-MET两个靶点的具有独特协同机制的BsAb。值得一提的是，岸迈生物于2017年4月宣布获得2500万美元的A轮融资。公开资料显示，岸迈生物还曾与信达生物达成1.2亿美元的技术合作，后者获得其专有BsAb技术使用权。

上海健能隆：健能隆医药建立了免疫抗体技术平台ITabTM（ImmunotherapyAntibodies），启动了一系列BsAb药物的开发，用于多种实体瘤和血液肿瘤的免疫治疗。利用该技术凭条设计合成的BsAb分子具有独特的结构特征，可在真核细胞中表达，易于大规模生产。2018年11月，健能隆医药宣布其创新型CD19×CD3BsAb药物A-319获中国国家药监局批准开展用于治疗B细胞恶性肿瘤的1期临床试验。据悉，A-319借助两个功能区分别与B肿瘤细胞表面抗原CD19及T细胞抗原CD3结合，在T细胞和肿瘤细胞之间形成突触，从而激活T细胞并引起肿瘤细胞溶胞而死亡。

上海宜明昂科：宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司创立于2015年6月，致力于肿瘤的免疫治疗产品的开发研究，在研产品包括针对免疫调节靶点的单克隆抗体、经过武装的靶点特异性NK细胞以及BsAb。公司针对CD47靶点的单抗已于2018年9月1日获得NMPA临床试验研究受理。

北京康众生物：康众生物的肿瘤T细胞生物治疗技术平台，基于其独创的羊驼纳米抗体快速分离技术，用于重点研发纳米抗体双特异性抗体（nanoBiTE）。BiTE(BispecificT-cellengager)技术是采用DNA重组技术将识别T细胞的CD3抗体与其它抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接形成单一的双特异性抗体，这种抗体能够介导T细胞和靶细胞之间形成溶细胞行免疫连接，有效杀伤肿瘤细胞。

北京天广实：是一家处于临床阶段的生物制药公司，具备国内领先的单抗药物研发和产业化技术能力并形成了完善的技术体系。根据CDE的数据显示，公司的“注射用重组人源化双功能单克隆抗体MBS301（HER2-D2/D4）”已于2018年8月27日获得临床批件。MBS301（美国授权专利US9,745,382B1）是全球首个岩藻糖全敲除的双功能抗体，能够同时结合HER2抗原的D2和D4结构域，从而起到帕妥珠和曲妥珠两个单抗药物联用的效果，拟开发用于HER2阳性的乳腺癌和胃癌治疗。

深圳本康生物：成立于2015年，主要从事生物制药和细胞治疗创新工具和技术解决方案的开发。公司技术团队中不乏出自安进、拜耳这些巨头公司的研发人才，依托公司在蛋白质工程领域多年的研究经验，公司储备了大量有望改造和提升细胞治疗技术的工具，涵盖BsAb药物开发、细胞培养方案及基于磁珠的细胞分离技术以及细胞检测等诸多方面。目前一共有5个BsAb药物，其中有三个正在展开临床试验，除了一项是在美国申报以外，其他两项试验尚未公布申报地点。

中山康方生物：AK-104是中山康方开发的一种BsAb，同时靶向于CTLA-4和PD-1。CTLA-4和PD-1是在肿瘤浸润淋巴T细胞上共表达的免疫检查点蛋白，康方研发的AK104能同时阻断这两个通路。2017年9月，AK-104在澳大利亚启动了临床一期试验，用于治疗晚期实体瘤。AK104是该公司研发的国际上首个（first-in-class）进入临床试验的同时针对CTLA-4和PD-1的NMPA。

杭州特瑞思：特瑞思是由国家“千人计划”专家吴幼玲博士领导的海外归国精英联合浙江民营企业家创立的，是一家集研发、中试放大和商业化生产、销售为一体的创新生物制药企业。公司拥有丰富的产品管线，其中2个BsAb处于临床前研究，分别是TRS008（治疗非小细胞肺癌、尿路上皮癌）、TRS009（治疗肺癌、黑色素瘤、膀胱癌，消化道肿瘤）。TRS008是特瑞思于2018年4月与上海岸迈生物合作引进的品种，浙江特瑞思该药的中国市场开发权益,岸迈生物将保留该项目除中国以外的全球商业权益。

荣昌生物：荣昌生物RC28-E注射液是VEGFR和FGFR双靶标融合蛋白，用于治疗血管新生相关的疾病。该药物有两种剂型，RC28-E为眼用剂型，用于眼底疾病，RC28-T为普通注射剂，用于肿瘤治疗。

根据公开信息，我们整理了国内已进入临床阶段的来自6家公司的8款BsAb（不完全统计），进展如下：

近期，国内公司在该研发领域的新进展不断传来。2019年1月10日，贝达药业宣布与Merus公司达成合作，获得后者一款针对EGFR和c-Met双靶点的BsAb在中国的开发和商业化权益。2018年11月30日，天境生物宣布与TRACONPharmaceuticals达成合作，共同开发天境生物自主开发的CD73抗体TJD5及一系列BsAb。2018年11月27日，百济神州宣布与Zymeworks公司达成合作，获得后者两款在研HER2靶向BsAb药物在部门国家和地区的开发和商业化的独家授权。除了这些与国际公司的合作项目，国内相关合作消息也频频传出。

除了以上几家公司，国内在BsAb领域布局的企业还有很多，大部分项目尚在临床前阶段。根据公开资料，国内还有恒瑞医药、正大天晴、丽珠医药、海正药业、天演药业、康众生物、腾盛博药、荣昌生物、先声药业、特瑞思、和铂医药、中美华世通、宜明昂科、本康生物、安科生物、博生吉医药等公司布局其中。

从靶点来看，以PD-1/PD-L1、CTLA-4及HER2为靶点的项目居多。如中美华世通围绕PD-1布局的多个BsAb，包括PD-1/CD47,PD-1/IL-10,PD-1/VEGF,CD47/VEGF等；天广实生物的注射用重组抗HER2-D2/D4人源化双功能单克隆抗体MBS301是一款岩藻糖全敲除的双功能抗体，能够同时结合HER2抗原的D2和D4结构域，该款药物于2018年3月获临床受理；康众生物开发的Her2双特异性纳米抗体SV201、CD20双特异性纳米抗体SV202及免疫检查点双特异性纳米抗体SV203均在临床前阶段。此外，不久前百济神州从Zymeworks公司获得的两款BsAb中，ZW25可以同时结合两个非重叠的HER2表位，开发用于治疗胃癌和卵巢癌，目前在美国和加拿大开展1期临床；ZW49是一种新型BsAb–药物偶联物（ADC），靶向两个非重叠的HER2表位，早前已在美国提交IND。目前有多个BsAb正在开展用于治疗肿瘤的临床试验，其结构中多包含CD3抗原结合位点（用于募集T细胞到肿瘤细胞附近），另一个结合位点包括CD19,CD20,CD33,CD123,HER2,CEA，神经节苷脂GD2，PSMA，gpA33等等。另外，还有一些BsAb为：HER2+ HER3, IL1α+IL1β,IL13+IL17, IL17A/IL17F和CD30+CD16A。

从国内的临床申报情况来看，尚处于快速发展的初期，从临床到真正上市还有相当长的路要走。据了解，BsAb的研发颇有门槛，尤其在产业化方面目前尚存挑战。希望在这些研发企业的不断努力下，相关临床研究能够顺利开展，产品能够早日上市，让新科学能够真正用于疾病治疗，惠及到患者。

部分终止临床的BsAb：在进入临床用于治疗肿瘤的BsAb中，共有8个临床试验被终止。

双特异性抗体是抗体药物领域最新的一个概念，被视为治疗肿瘤的第二代抗体疗法。国内虽然有多家企业布局BsAb领域，但多处于临床前研发状态，进入临床阶段仅有武汉友芝友、苏州康宁杰瑞、北京天广实等几家企业。作为一种前瞻技术，其在产业化面临诸多挑战，如解决错配和纯化，改善下游工艺不稳定，保证双抗的稳定性和平衡两个抗体的表达量等。随着技术的进步，相信未来可以利用更多更好的策略来优化各种BsAb，使其具有更强大的疗效和更低的副作用，为肿瘤患者带去福音。

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