轮状病毒疫苗：为什么继续投资研究是必要的？

Ruth Bishop及其同事在1973年首次鉴定了轮状病毒是导致儿童严重流行腹泻疾病的原因。近25年后，第一个轮状病毒疫苗，RotaShield™由FDA批准并获得上市许可。出于对肠套叠发病率增加的担忧导致在其推出后不到一年RotaShield疫苗撤出市场。在撤销RotaShield疫苗后，Rotarix TM（RV1，GSK Biologics，Rixensart，比利时）和RotaTeq™（RV5，Merck and Co，Westpoint，Pennsylvania）疫苗数十年的研究和临床试验遭受重大挫折，而且在发布之前花了近10年的时间。 RotaTeq和Rotarix疫苗已在全球范围内商业化，并已被世界卫生组织推荐列入在世界所有国家免疫规划中。这两种疫苗在包括80多个国家的疫苗规划中。在此外，其他减毒活疫苗已经或正在研发，包括RotaVac（印度），Rotavin-MI（越南），兰州羊株（中国），一种牛UK重组疫苗株（美国，印度和巴西）和RV3BB（澳大利亚）。

疫苗的使用极大地减少了轮状病毒引起相关腹泻的发病率。研究显示1985年估计每年与轮状病毒相关的全球死亡人数为873,000，2008年为453,000，2013年为21.5万。虽然疫苗在高收入国家，效力范围从84％到98％不等，但在轮状病毒相关疾病导致的死亡大多数发生在资源贫乏的地区，其效力范围仍低于60％。继续研究以提高我们对轮状病毒复制、遗传学和发病机制的理解，不仅可以预知未来改进疫苗的设计，它也会增强我们对其细胞生物学、免疫反应和疫苗学的一般知识。 

轮状病毒现在划分为八种不同的种属，轮状病毒A-H，以及另外两种推荐的种属，轮状病毒I-J。在这些种属中，轮状病毒A（在这里简称“轮状病毒”）是绝大多数人的感染源，但也能感染众多的哺乳动物和禽类宿主。轮状病毒属于呼肠弧病毒科，其基因组由11个片段组成，由三层结构包围的双链RNA形成无包膜二十面体的蛋白质颗粒。该最外层由两种病毒蛋白VP4和VP7组成，它们是中和抗体的主要靶标。主要的轮状病毒分类系统是基于VP7和VP4的血清型（分别称为G型和P型），但后来扩大到包括所有11个基因组片段的基因分型。至少35种G型和50种P型已被确定，但新的基因型继续被发现。尽管存在大量的基因型，但只有6个G型（G1，G2，G3，G4，G9和G12）和3个P型（P [4]，P [6]和P [8]）通常与人轮状病毒疾病相关。

轮状病毒的分段基因组容易发生重排，从而使两个或两个以上的病毒段可以混合在共同感染的细胞中并包装成新生的病毒颗粒。重配导致轮状病毒毒株遗传多样性，但在复制过程中聚合酶引入突变错误倾向性也是遗传多样性的重要来源。重配在轮状病毒疫苗的产生中起着重要作用，允许轮状病毒减毒动物株和具有外壳蛋白的普遍流行的人类株组合。重配也是一种有价值的实验室工具，广泛地用于将表型性状映射到单个基因产物和作为反向遗传学早期方法的基础系统。

轮状病毒感染成熟的小肠绒毛（肠细胞）上部的上皮细胞。病毒介导的肠细胞破坏导致肠绒毛钝化，从而吸收障碍，还有几个其他的因素也参与轮状病毒的发病机制。轮状病毒感染引起的呕吐和腹泻大约持续7～10天，这通常比其他病毒导致的肠胃炎持续时间显著延长，并且由此产生的脱水可能是致命的。感染患者应用补液治疗，但接种疫苗是预防严重腹泻疾病的最佳方法。

轮状病毒感染不会产生杀毒免疫力;因此，接种疫苗的目标是减少或消除严重腹泻。已显示抗体能对后续轮状病毒感染提供保护作用，但CD8 ⁺ T细胞对于轮状病毒感染的解决是很重要的。轮状病毒特异性IgA在肠液中可能是预防后续保护严重疾病的最佳预测指标，但测量十二指肠中和抗体是不切实际的。粪便IgA已被几项研究评估，似乎与肠道IgA水平相关。血清IgA和血清IgG的测定与保护有关，但在已发表的研究中与检测误差，取样时间和抽样设计导致改变带来挑战。此外，关于预测疫苗效力的抗体的浓度还没有达成一致;改善新型疫苗开发和临床试验与保护性指标需要更好的设计。增加基础研究识别其他保护指标将有助于改善我们对轮状病毒免疫保护机制的认识。

防止轮状病毒感染优先开发疫苗，几乎所有的儿童都感染了轮状病毒至少一次。包括胃肠炎在内的严重症状腹泻和/或呕吐，在第一次时感染轮状病毒时最常见。随后的感染通常是不太严重，可能无症状。感染两次后防止轮状病毒感染的中度和重度疾病接近100％。因此，努力开发一种轮状病毒疫苗主要集中在口服给药，轮状病毒减毒活疫苗会模仿自然感染而不会导致疾病。

轮状病毒疫苗开发的最早阶段使用 “Jennerian”的方法，其中一种相关的减毒活病毒来自非人类动物的宿主被用作免疫原诱导对严重疾病的保护。但是，由于许多不同的轮状病毒血清型/基因型在全球流通，一种“改良的Jennerian”方法被用于覆盖更广泛的抗原。已经过安全检测的动物轮状病毒株已被使用产生人 – 动物轮状病毒重配株，来自不同人轮状病毒的VP7外壳蛋白血清型进入背景清楚动物病毒分离株。多价疫苗被认为是必要的，以确保足以防止多种循环病毒血清型。上市后监测已经证明针对疫苗中不存在的菌株有交叉保护，尽管交叉保护并不总是完全对抗严重疾病。

获准使用的第一种轮状病毒疫苗是四价重配的恒河猴 – 人轮状病毒RotaShield，，实施后不到1年，由于与每10,000名疫苗接受者中大约1例肠套叠病例过度相关，这种疫苗在1999年从美国市场撤出。肠套叠是指一段肠管套入与其相连的肠腔内，并导致肠内容物通过障碍引起的肠梗阻。 RotaShield的撤回发生在任何疫苗接种后的许可证数据都是可用的之前，引发了关于风险收益的冗长而重要的争论。由于与肠套叠有关，大规模的临床试验是评估与RotaTeq和Rotarix疫苗肠套叠风险的必要评估手段。 RotaTeq是一种五价牛 – 人重配组合物，而Rotarix是一种来自人类病毒分离株的单价疫苗。RotaTeq和Rotarix临床试验在拉丁美洲、美国和欧洲表现出85～98％抗严重轮状病毒胃肠炎感染的疫苗疗效。美国自2006年疫苗实施以来，因轮状病毒而住院5岁以下儿童减少60～83％，由于腹泻的所有原因而住院，与疫苗接种前相比减少29～50%。此外，有证据表明轮状病毒传播减少，由于年龄太大而不能接种疫苗的儿童和成人中表明群体免疫对减少腹泻病例有影响。美国自从疫苗引入以来，轮状病毒的季节性在今年晚些时候开始，持续时间短，并且幅度减小。

在许多资源贫乏的国家已经记载了较低的疫苗效力。在加纳、肯尼亚和马里使用RotaTeq的试验显示了在生命的第一年的疗效为64%。在越南和孟加拉国研究表现出51％的疗效。在南非和马拉维进行的Rotarix试验发现该疫苗有效率为40～64％。对于较低的疫苗疗效的原因尚不清楚，而且对于在这些地方大多数人由于轮状病毒发生而失去生命的重要的研究是必要的。

对其他口服疫苗的免疫应答，如脊髓灰质炎和霍乱，在资源贫乏的地区一致，也越来越少。营养缺陷可能是导致疫苗疗效降低的一个原因，缺乏特定的营养因子的摄取，包括锌、维生素A和维生素D可减少疫苗发挥作用。预先存在的母体抗体可能对口服疫苗有中和作用。虽然母乳喂养是母体抗体可能来源，但有多项研究证明轮状病毒使用前母乳喂养婴儿，与无限制母乳喂养婴儿比较，疫苗注射式使用不会影响血清阳转率。

在资源匮乏的国家，遗传多样性更加丰富并且可能出现新的和不寻常的轮状病毒株，这也可以解释一些疫苗效力降低的原因。鉴于已证明交叉保护出现，更多的变异株可能只是疫苗疗效低的部分原因。生命早期共生菌群定殖是粘膜免疫应答的免疫学发展中起重要作用。微生物群在口服疫苗摄取中的作用没被很好理解，但轮状病毒疫苗免疫原性与微生物群的组成有关。最近，一项研究显示益生菌补充剂对轮状病毒疫苗接种有影响，但对疫苗免疫原性无显著改善。益生菌和补锌提供了适度的改善，但进一步调查将是必要的。在发展中国家口服疫苗的失败最有可能归因于环境性肠病，即由持续的粪便口腔污染导致肠道炎症引起的亚临床症状。慢性暴露于粪便病原体被认为是会引起小肠炎症和结构改变，这可能会导致肠道吸收和免疫功能的损伤。伴随感染的肠道也可能直接干扰口服活疫苗的摄取。因为环境肠病可能是导致除轮状病毒外疾病疫苗疗效降低的主要原因，应该有着重的的研究推动了解这种情况。

轮状病毒是在出生第一年的腹泻样本中检测到的主要病原体，轮状病毒在婴儿发病率中的比例是任何其他病原体的两倍以上。引入轮状病毒疫苗，即使效力低，在资源匮乏的环境中由于疾病而造成严重负担，也有巨大的影响或作用。在像马里这样的环境中，2016年出生人群有758,000人，效力为60％的疫苗可以预防约有31,500例1岁以内危及生命的轮状病毒感染病例。然而，在遭受最大疾病负担的国家改善轮状病毒疫苗疗效将对减少这种疾病死亡人数和缓解医疗保健负担产生最大的影响。

研究工作需要着眼于理解在资源匮乏地区疫苗效力低下的原因

以便可以改进疫苗在这些条件下的效能。对已实施轮状病毒疫苗规划的国家一直在进行上市许可后的监测。这种监测将继续进行，监测疫苗菌株在粪便排出的重要性是度量群体免疫力的下降，以确定随着时间的推移，病毒的循环菌株发生可能的变化，并进行跟踪观察与疫苗接种有关肠套叠。疫苗有效性的变化随着时间的推移可能会加速推进当前疫苗或新疫苗的开发进程。理想的情况下，一种疫苗只需单剂量就能有效地预防严重的疾病，这将会对捕捉到更多的易感人群增加影响。其他轮状病毒候选减毒活疫苗需继续开发，但该领域必须首先获得更多完全了解口服疫苗摄取减少的原因。

不幸的是，目前允许上市使用的轮状病毒疫苗存在一些禁忌症，包括先前口服轮状病毒疫苗剂量后严重的过敏反应、严重联合免疫缺陷（SCID）或肠套叠。没有得这些禁忌症的孩子受益于非复制疫苗的研发。轮状病毒疫苗使用也受到年龄限制，因为在15周后接受第一剂疫苗的儿童中肠套叠风险增加。轮状病毒疫苗上市的监测发现6～12周龄儿童口服RotaTeq和Rotarix之后肠套叠风险略有增加（每10万疫苗接种者有1～6例以上病例）。 虽然接种疫苗的整个好处大大超过这个风险，非复制性疫苗可能会减少或消除这种疾病。

了解病毒蛋白质上的中和抗体表位一直是疫苗开发的重要考虑因素，特别是对于非复制型疫苗。非复制疫苗亚单位通常利用病毒的VP4和VP7外衣壳蛋白，因为这些蛋白质是抗体应答的关键目标。在轮状病毒感染期间，VP4蛋白被宿主蛋白酶切割成VP5 *和VP8 *。 VP8 *亚基与破伤风毒素P2表位融合的蛋白疫苗的开发一直在进行中。最近该疫苗在婴儿Ⅰ、Ⅱ期临床研究中已经表明该疫苗具有免疫原性的，同时可减少随后感染中的病毒排出。然而，缺乏异型免疫表明亚单位疫苗需要加入不同的轮状病毒血清型提供更广泛的保护。确定异型免疫的分子基础最近发生了戏剧性的大步前进，即在成人的肠B细胞研究中证明了针对轮状病毒的异型免疫球蛋白主要是VP4的茎区（VP5 *）。异型保护也针对VP4细胞结合区域（VP8 *）和VP7外壳蛋白，但程度较轻。针对VP7和VP8 *的免疫球蛋白倾向于同型或非中和，这表明VP4的茎区域对产生更广泛有效的轮状病毒疫苗是有用的目标。

VP6蛋白形成轮状病毒衣壳的中间层，并且在轮状病毒中高度保守。VP6蛋白已被探讨为另一种可能的候选亚单位疫苗，部分原因是因为当体外表达时，VP6可以组装为纳米管，它提供了一些天然的佐剂特性。在自然轮状病毒感染期间，产生一个重要的抗VP6抗体应 答。小鼠特异性VP6抗体已显示可保护小鼠免受轮状病毒感染，鼠抗-VP6抗体在早期感染阶段可以抑制病毒在极化上皮细胞内复制。虽然抗轮状病毒抗体看起来是减毒活疫苗免疫后保护的主要效应物，但研究发现CD4 ⁺ T细胞能减少用重组VP6免疫小鼠后的病毒排出。因此，似乎在对轮状病毒免疫的保护性应答中存在一些差异，这取决于给药途径以及是减毒活疫苗还是非复制疫苗。

病毒样颗粒（VLP）是另一种潜在的非复制候选轮状病毒疫苗。轮状病毒VLP是通过使用杆状病毒表达系统共表达病毒结构蛋白而产生。 VLP疫苗已在动物模型中进行免疫原性验试，但尚未经过人体验试。面临正在开发的非复制型候选疫苗的一个挑战是都需要考虑各种流行病毒株。使用非复制型轮状病毒疫苗可以提供与其他抗原组成配方的好处，例如来自诺如病毒，以提供多重保护病原体。轮状病毒亚单位疫苗和VLP疫苗的研究仅处于早期阶段; 因此，进一步的工作是开发安全，且高免疫原性的制剂, 并提供足够的抗多重血清型的交叉保护至关重要。此外，更好的佐剂配方将有利于许多病原体的疫苗开发，包括轮状病毒，需要改善在婴儿不成熟的免疫系统中的应答。然而，新疫苗进入市场可预期的成本减缓了非复制候选疫苗的研制。

改进轮状病毒疫苗的一种可能的方法是修饰负责毒力的基因，以减弱人毒株的毒力。 然而，基因和它们负责毒力产物存在信息冲突。 在一些模型中，VP3，VP4，VP7和NSP4已经显示了负责毒力。毒力的判定和检测方法的研究差异很大。 另一方面，宿主范围限制，即从一种宿主物种分离的病毒株倾向于减少异源宿主的复制能力和毒力，可以特异性地通过异源病毒与同源病毒在小肠的复制病毒减少相比来测量。最近强有力的证据表明提供用于支持黏着蛋白质VP4和干扰素拮抗蛋白NSP1作为宿主范围限制的重要介质。干扰素系统似乎也是如此对限制异源性轮状病毒感染的肠道病毒复制具有影响并可能是病毒株的宿主范围决定因素。虽然我们对宿主范围限制的理解目前是有限的，但确定病毒如何从人以外的其他宿主分离的分子机制不能导致严重的疾病对改善轮状病毒疫苗是必需的，它也能成功地适用于依赖于宿主限制的病毒感染的其他疫苗（如天花）研发。

轮状病毒引起的干扰素介导的抑制细胞凋亡的分子基础并不了解，但这对控制感染来说显然很重要，因为已经知道轮状病毒编码超过一种先天免疫应答的拮抗剂。但它对抗感染非常重要因为轮状病毒已知能编码一种以上的先天免疫应答的拮抗剂。非结构性的蛋白质NSP1通过阻止I型干扰素的诱导抑制先天免疫应答。 NSP1主要被描述为诱导蛋白酶体降解起始干扰素应答所需的几种细胞蛋白质，并且降解的目标似乎是取决于轮状病毒是否自然感染人或是不同的动物宿主。围绕着NSP1如何诱导蛋白质降解的分子细节有些争议，有一些数据支持了NSP1作为E3泛素连接酶发挥作用，而其他数据表明它会夺取宿主滞蛋白-RING泛素连接酶复合物。如果NSP1在特定宿主种类参与促进复制，那么NSP1抑制干扰素应答的机制必须明确定义为改进疫苗的有用目标。已被证明另一种病毒蛋白可以抑制

干扰素产生的下游先天免疫应答是成帽蛋白VP3。 VP3具有磷酸二酯酶活性，能切割干扰素诱导2’，5′-寡聚腺苷酸，从而阻止有抗病毒活性的RNA酶L的激活。尽管可能假定RNase L直接抑制轮状病毒的复制，但是这种干扰素刺激的基因产物对轮状病毒的作用尚未检查。普遍缺乏围绕直接抑制轮状病毒进入、复制、包装的先天免疫效应物的相关知识。干扰素刺激的基因控制轮状病毒生命周期中的步骤的研究工作可能有助于鉴定可以控制轮状病毒的其他感染方式，也可以提供这些重要的细胞通路是如何限制病毒感染的洞察力。此外，描述病毒免疫应答的拮抗机制在很大程度上归功于提供我们了解先天免疫系统如何发挥作用，因此应该继续作为许多病毒研究一个重要领域。

   先天免疫系统对婴儿免受细菌和病毒感染很重要，因为它提供了一个快速、抗入侵病原体的早期防御。婴儿没有完全产生适应性免疫应答，因为它们尚未广泛接触外来抗原。一些体外和体内研究表明，先天性免疫效应物有助于抵抗轮状病毒感染，这可能在轮状病毒感染的年龄限制中发挥作用，但还有很多东西需要学习。研究提示了Toll样受体3，是轮状病毒感染年龄相关易感性的先天免疫应答的一种双链RNA传感器。缺乏III型干扰素受体的小鼠也显示出不能很好地控制轮状病毒感染，提示III型干扰素在限制轮状病毒和其他肠道病毒感染的作用中具有重要意义。在某些情况下，发现成年小鼠的肠上皮细胞对I型干扰素无应答，但后续研究表明肠道上皮细胞对I型干扰素的年龄相关的应答性变化，在新生儿的强烈应答到随着小鼠成熟而减弱。剖析I型和III型干扰素系统限制轮状病毒等肠道感染的方式可能会提供对许多重要的病原体年龄和宿主限制复制的重要信息，但这些重要问题需要作进一步研究。

为什么我们需要继续研究轮状病毒？在资源匮乏的国家和地区疫苗效力减少以及将某些患者排除在轮状病毒接种之外，说明改进疫苗设计是很必要的。为了使最合理的改进成为可能，必须围绕对轮状病毒先天的和适应性免疫应答有一个更深入的知识基础，对其病毒靶标进行修改可以改进疫苗和靶标病毒蛋白如何发挥作用的机制。还必须持续监测疫苗的有效性确定轮状病毒的常见流行株是否会随着时间的推移发生变化，或者如果通过自然变异出现新的致病性轮状病毒毒株。在理想情况下，应继续研究开发新的疫苗可快速适应未来爆发可能的病毒株。但是还有很多关于轮状病毒的问题应该得到解决，这不仅仅是因为确定轮状病毒如何复制并与宿主相互作用的价值，更是因为它们推动了对免疫学、分子病毒学和细胞生物学作为一个整体的更深入的理解。对轮状病毒感染的易感性如诺如病毒所提出的那样做组织血型抗原进行确定吗？病毒诱导的复制物（病毒体）组织的中心是怎样的？它们是潜在的药物靶点吗？一种病毒是如何协调分段的基因组编排时间和正确数量的基因组片段的包装呢？干扰素是通过什么机制抑制轮状病毒复制，且干扰素是宿范围限制的一个关键因素吗？最近基于完整质粒的反向遗传学系统的研发是一项期待已久的突破，提供了研究轮状病毒生物学许多新的的机会，对容易插入特定的突变或基因片段到病毒是创造新的候选疫苗株将产生极大的影响。

原文来源：Arnold MM. Rotavirus Vaccines: Why Continued Investment in Research Is Necessary. Current clinical microbiology Reports, 2018, 5:73-81

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