双特异性抗体分析那点事

这个周末对于生物药圈的各位同仁来说FDA在2019.04.18发布的仅6页正文的《Bispecific Antibody Development Programs》绝对可以算做一个热点。虽然这个行业指南并不是关于分析方面的，但是作为生物药圈的一员，这个热度还是要蹭一下的，也希望能给大家带来一些启示。

背景

Bispecific antibody中文翻译为双功能抗体，简单说来就是可以同时识别两个位点的抗体。根据FDA这篇行业指南的划分，主要可以分为两大类。一类为连接两种靶细胞的双功能抗体（如同时连接免疫效应细胞和肿瘤细胞以达到增强杀伤作用的双功能抗体），此类双功能抗体需要同时连接至两种靶细胞才能更好的发挥作用；另一类为不连接两种靶细胞的（如连接2个不同细胞因子或者是连接肿瘤细胞两个不同位点的双功能抗体），此类双功能抗体发挥作用无需同时连接两个靶点。【1】

通过文献的检索，发现实际根据双功能抗体的作用机制，分类方式五花八门。如图所示，就分成了6个类别【2】。不但类别多，作用机理也基本是case by case了【3】。因此对于双功能抗体FDA在这个行业指南里的基本基调也是具体问题具体对待。

对于生物分析

此行业指南中也对双功能抗体的生物分析提出了一些总体性要求。具体描述见截图。

对于药物浓度的检测，永恒的话题就是free，bound or total。一般而言可以简单归类free的药物浓度对于PK更有意义，total的药物浓度对于TK更有意义。bound的药物浓度则跟药效更加相关。

检测方面往往可以通过分析format的设计来达到检测free，bound or total的目的。如图【4】，可通过抗原夹心或者抗体（抗独特型抗体）夹心的方式检测free型药物，通过抗原搭配非特异抗体来检测free+bound型药物，通过非特异性抗体夹心来检测total型药物。

除了分析format的设计，也可以通过特殊处理（如酸化处理）的方式来进行药物的检测。通过酸化的方式使得bound的药物分子与靶点/抗药抗体的连接被打破。从而可以更加灵活的对total型药物进行检测。

正如FDA在指南中所说，根据检测的目的不同，往往需要使用一种或多种检测的组合进行双特异性抗体的生物分析。如free型方法+total型方法。

对于免疫原性分析

此外，对双功能抗体的免疫原性分析也提出了一些总体性要求。具体描述见截图。

对于双功能抗体的抗药抗体分析往往不能只停留在抗体本身的阶段，由于其结构和功能的特殊性，在免疫原性分析时需要从风险的角度出发，在产生针对全分子的抗药抗体后需要进一步分析抗药抗体所针对的结构域。具体的操作方式如下图所示。【5】对于多结构域的抗药抗体分析往往是在传统免疫原性分析流程中通过加入特异性的结构域抑制以判断抗药抗体的结合位点特异性。

结语

随着生物药生产技术的提升，给药物评价和分析带来了新的挑战。这边FDA刚刚出了双特异性单抗的行业指南，那边三功能抗体已经在临床试验中火热进行，四功能抗体也已经跃跃欲试。。。我辈只能继续边做边学了。

参考文献：

1，FDA行业指南《Bispecific Antibody Development Programs》 

https://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm636248.pdf

2，Trivedi A, Stienen S, Zhu M, et al. Clinical Pharmacology and Translational Aspects of Bispecific Antibodies[J]. Clinical and Translational Science, 2017, 10(3): 147-162.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5421745/#cts12459-bib-0082

3，Runcie K, Budman D R, John V, et al. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics[J]. Molecular Medicine, 2018, 24(1).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6154901/

4，Lee J W, Kelley M M, King L, et al. Bioanalytical Approaches to Quantify “Total” and “Free” Therapeutic Antibodies and Their Targets: Technical Challenges and PK/PD Applications Over the Course of Drug Development[J]. Aaps Journal, 2011, 13(1): 99-110.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3032085/

5，Gorovits B, Wakshull E, Pillutla R, et al. Recommendations for the characterization of immunogenicity response to multiple domain biotherapeutics[J]. Journal of Immunological Methods, 2014: 1-12.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175914001550?via%3Dihub

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