以端粒酶为靶点的癌症免疫疗法

为了类似的人类的多细胞生物的生存，需要形成不同器官的细胞网络保持其稳态和功能。癌症是由突变导致的异常细胞的集合体。这种细胞会通过在不受控制的方式下进行复制和增殖、浸润组织并转移到远端器官来对正常细胞网络造成损伤，最终导致生物体的死亡。癌细胞能采取这种方式的机理之一就是受到了端粒和端粒酶的控制。

DNA复制为细胞的分裂和增殖所必需。在DNA多聚酶介导的复制循环中，DNA双链的端粒区都不会被完整复制。因此，在每次循环中都会造成端粒丢失。端粒保护着染色体的末端，端粒的缩短造成DNA链末端的暴露。由此DNA不再进行复制，细胞停止复制并最终死亡。在我们体内，这个机理防止细胞具有产生癌变的异常增殖能力。另一方面，很多癌细胞由于具有活性形式的端粒酶而能保持端粒完整。因此，如上所述，端粒酶帮助癌细胞无限分裂并且行为失去控制。

到目前为止的研究将癌细胞生存的潜在机理作为癌症治疗的靶点进行了测定。这些尝试导致了端粒酶抑制剂、以端粒DNA为靶点的药物、携带人端粒酶反转录酶（hTERT）基因组启动子的病毒载体以及以hTERT免疫疗法等抗癌药物的发展。此外，最近的研究表明在hTERT基因启动子区突变频繁而端粒酶的活性在肿瘤产生中发挥了主要作用。这些发现使得研究者重新考虑使用以hTERT为靶点的疗法。本综述关注的是以hTERT为靶点的免疫疗法，将对近期的例证和未来的展望进行讨论。

癌症免疫疗法被认为是手术、化疗以及放疗之后的第四种主流癌症疗法，其中包括细胞因子、抗体、检查点抑制剂以及诸如树突状细胞（DC）和T细胞的使用。在不同类型的癌症免疫疗法中，检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已经在临床条件下被成功用于癌症的治疗。与传统的以癌细胞为靶点的疗法不同，这些癌症免疫治疗策略是全新的，因为他们的靶点是宿主免疫系统从而会造成癌症治疗中标志性的变化。基于这些癌症免疫疗法的成功，癌症和免疫学研究再一次强调了T细胞识别肿瘤抗原后消除癌细胞的作用的重要性。

以癌症特异性免疫反应为靶点的癌症免疫疗法开发的第一步在于确认作为靶点的肿瘤相关抗原（TAA）。目前，已经确认了包括肿瘤/睾丸抗原在内的多种TAA以及癌胚抗原（CEA）并将其作为免疫疗法的靶点。一旦一个癌细胞通过诸如细胞凋亡等机理死亡，其细胞内部组分就被释放到环境中并树突状细胞（DC）的内含体内化。通过内化，TAA被降解并形成包含10-20个氨基酸的长链多肽，后者会与细胞表面表达的II型主要组织相容性复合体（MHC）分子相结合。通过CD4⁺辅助T细胞（Th）上的T细胞受体（TCR）对这些肽进行识别导致这些Th细胞的激活。DC还将TAA输出到细胞浆中，然后在那里被蛋白酶体所降解并形成由9-11个氨基酸组成的短肽。一旦这些多肽与I型MHC分子结合并在细胞表面表达，就会被CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的TCR所识别并激活了CTL。CTL是杀伤癌细胞的重要的效应细胞。

确认新的TAA的技术包括cDNA文库（SEREX）表达的血清学分析以及cDNA芯片。在确认了TAA的氨基酸序列，可以通过算法分析和表达人白细胞抗原（HLA）的转基因小鼠模型来确认能诱导I型MHC限制性的CTL的多种短肽。

hTERT就是这样的一个TAA，并且在85%的肿瘤上过表达，包括造血组织和肿瘤和实体肿瘤。这些抗原仅局限在睾丸细胞、造血、基底角质细胞、以及激活的淋巴细胞等正常细胞上表达。因此hTERT成为一个具有吸引力的免疫疗法靶点，其中还包括一个针对癌症的方法的靶点。到目前为止的研究表明来自于hTERT的短肽和长肽与I型和II型MHC分子形成复合体；这些复合体然后就在细胞表面表达而在体外引发CTL和Th细胞反应。因此hTERT具有免疫原性，被认为是可以用于激发抗肿瘤免疫的通用TAA。实际上，多种hTERT来源的肽被确认为癌症免疫疗法的靶点。

安全性方面，在一系列各类癌症中对几个使用hTERT来源的肽疫苗的免疫反应以及抗肿瘤活性进行了评价。这些疫苗中大部分都对肿瘤高度特异并且其氨基酸序列中具有MHCI类和MHCII类表位。近来，超过30中hTERT多肽被用来进行模拟表位，即模拟表位的结构。尽管其中很多被表达于MHCI类分子上并能加强CTL反应，另一些则表达于MHCII类分子上并发挥诱导Th细胞反应的功能。表2中对基于hTERT来源表位的疫苗进行了说明。这其中包括了几种药物，诸如GV1001（与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子合用）、GX301、GRNVAC1以及VX-001，在之后的章节会进行说明。

4.1 GV1001

GV1001是一种II型MHC限制性肽疫苗，包含来自hTERT活性位点的16个氨基酸（611-626，EARPALLTSRLRFIPK）。该药物需要GM-CSF或Toll样受体7（TLR-7）作为佐剂并具有激发CD4⁺和CD8⁺T细胞反应的能力，此外还能激活CTL。除了免疫学机理，之前的研究表明GV1001直接作用于细胞。GV1001能穿透细胞膜并特异性定位于细胞浆中，降低细胞内和细胞表面的热震惊蛋白（HSP）水平。此外，在肿瘤中的缺氧条件下，此药还能降低HSP90、HSP70、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）以及血管表皮生长因子（VEGF）。GV1001已表明具有高水平的抗肿瘤活性，因为它是具有细胞穿透能力的肽。在肾细胞癌中，GV1001可以通过减少血管生成而诱导癌细胞凋亡。除此之外，还有证据表明GV1001具有抗炎和抗病毒活性，此外还能保护中枢神经系统中由β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性。

GV1001是所有以hTERT为靶点的疫苗中最为先进的疫苗，并且是第一个进行非随机临床试验的疫苗。它作为疫苗针对多种癌症的治疗进行了试验，诸如晚期胰腺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）以及黑色素瘤。目前为止的临床试验结果如下。首先，一项I/II期临床试验表明GV1001在50-80%的晚期胰腺癌和肺癌病人中诱导特异性T细胞反应且未发现临床毒性。在肺癌病人中进一步的临床试验发现GV1001导致CTL和CD4⁺T细胞反应。此疫苗的优点之一是可以不用对病人进行HLA-分型；因此，最理想条件下此疫苗可以成为通用癌症疫苗。

GV1001的有效性还在和其他肽类疫苗合用时得到了证实。一项I/II期试验表明将GV1001和端粒酶的HLA-A2限制性CTL表位（HR2822；hTERT540-548）合用在NSCLC病人中引发了免疫反应且安全性良好。在该试验中，86%的病人产生了免疫反应，其中有一个病人产生了完全反应。该试验还检测了GV1001的作用机理，并表明GV1001特异性的Th细胞识别的抗原递呈细胞（APC）将肿瘤和淋巴结中的癌细胞内吞了。除此之外，疫苗不影响B细胞。还有其他一些临床试验检测了将GM-CSF、替莫唑胺以及p540肽与GV1001合用的效果。一项在胰腺导管癌病人中展开的研究表明将GV1001和吉西他滨合用可以导致肿瘤细胞死亡并显著减少肿瘤内的纤维组织。但是，在一项在转移性胰腺癌病人的III期试验中，将GV1001配合化疗（吉西他滨和卡培他滨）并不能提高整体生存。

4.2 GX301

GX301是1个由4个hTERT来源的肽（hTERT540–548，hTERT611–626，hTERT672–686和hTERT766–780）组成的疫苗。此疫苗与I型和II型MHC分子都能结合，并含有montanideISA-51以及咪喹莫特作为佐剂。在一项IV期前列腺癌和肾癌病人中进行的I期临床试验中，所有的病人都至少对一种肽具有免疫反应。这项临床试验意味着与单个肽疫苗相比，多型肽疫苗更为有效，因为它可以加强更多患者体内的免疫反应。

4.3 UV1

UV1是一个最近才被披露的第二代端粒酶肽疫苗。此疫苗是长期癌症生存者中发现的3个最常见的hTERT来源的肽组成的，其序列为hTERT691–705（RTFVLRVRAQDPPPE）、hTERT660–689（ALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRA）以及hTERT652–665（AERLTSRVKALFSVL）。在一项在转移性激素性前列腺癌病人中进行的I/IIa期临床试验，将此疫苗与免疫调节因子GM-CSF联合给药6个月。该疫苗在85.7%（17/21）的病人中引发了免疫反应并降低了64%的病人体内的前列腺特异性抗原。核磁共振成像（MRI）进一步证明了，在接种后45%的病人前列腺内的肿瘤消失了。大多数与疫苗相关的不良事件按级别进行了分类。

4.4 Vx-001

Vx-001是一个由两种肽组成的疫苗：hTERT-来源的低亲和力隐藏性hTERT肽（RLFFYRKSV）以及经过优化突变的hTERT肽（YLFFYRKSV）。后者通过将第一个氨基酸置换为酪氨酸残基而加强了对I型MHC分子的亲和力。已经在诸如NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌以及胆管癌等多种不同类型癌症的I/II期临床试验中表明了其有效性。除此以外，在这些试验中，该疫苗引发了强烈的hTERT特异性免疫反应，有着较好的耐受性，仅仅引起了较温和的副反应并且提高了临床疗效。

DC是人体内最有力的抗原递呈细胞，在诱导适应性免疫中发挥了重要的作用还支持着固有免疫反应。在过去的10年里，DC在癌症免疫疗法中被作为诱导有效的抗肿瘤反应的工具。在美国，一个名为sipuleucel-T的DC疫苗得到了FDA的批准被用于治疗转移性前列腺癌病人。sipuleucel-T是一个使用肿瘤抗原（前列腺酸性磷酸酶（PAP）融合蛋白）培养的DC细胞产品，而且在一项III期临床试验中延长了大约4个月的生存。还在以hTERT为靶点的免疫疗法中对DC的使用进行了调查。

5.1 GRNVAC1

GRNVAC1是一个以DC为基础的癌症疫苗，是通过将编码hTERT和溶酶体相关膜蛋白（LAMP）1的mRNA转染成熟DC而成的。LAMP1将hTERT携带入溶酶体，并在其中将其降解为小分子肽。在接种代表hTERT肽的不同部分的疫苗后，抗原表位通过DC被递呈。目前为止的临床试验表明GRNVAC1安全且耐受良好。在转移性前列腺癌病人中进行了一项检测转染了编码LAMP1和hTERT嵌合蛋白mRNA的DC的疗效。GRNVAC1不会激发自身免疫反应，病人对于疫苗的多次给要耐受良好。此外，疫苗在病人人群中通过抗原特异性的CD8⁺和CD4⁺T细胞诱导了免疫反应。报告还表明疫苗长期给药对于急性髓细胞白血病病人有效。另一个DC疫苗GRNVAC2也是用和GRNVAC1相同的方法制造的，差别在于其中的DC来源于人胚胎而非血细胞分离。GRNVAC2可能是更好的运输系统。这些疫苗可能优于肽类疫苗，因为不受HLA限制而对于具有未知T细胞表位的肿瘤有效。

此外还进行了一些实验来检测hTERTDC疫苗的不同给药方法。例如，一项试验检测了同时转染了编码生存素和hTERT肿瘤抗原的mRNA且被沉默了吲哚胺-2,3-二氧化酶（IDO）基因的DC疫苗的疗效。此项试验中，疫苗在经过伊匹木单抗治疗的转移性黑色素瘤病人体内诱导了针对生存素和hTERT的T细胞反应。除此之外，在外周血细胞中检测到了针对T细胞识别的黑色素瘤相关抗原（MART-1）和NY-ESO-1的T细胞反应。接受治疗的病人在肺、肝和皮肤的转移降低，整体疗效有所提升。另一项试验则对使用编码hTERTcDNA的重组腺病毒技术进行了检测。通过此法制造的DC被用于在体外利用自体T细胞生产hTERT特异性的CTL。此技术导致了抗原的表达并加强了CTL的反应。

5.2 肿瘤抗原递呈细胞

另一个使用DC的方案是生产名为肿瘤抗原递呈细胞（TAP细胞）的治疗性DC样细胞。已经在I/II期临床试验中对超过120名III期和IV期黑色素瘤病人和20名手术耐受的前列腺癌病人进行了TAP细胞疫苗的评价。在这些试验中，疫苗显著提升了黑色素瘤病人的生存率，延长了PSA的倍增时间并在前列腺癌病人中激发了T细胞反应。除此之外，超过60%的病人产生了针对裂解物的迟发性超敏反应（DTH）。这意味着治疗强化了与临床疗效相关的抗肿瘤免疫记忆。试验还表明TAP细胞疫苗使Th1和Th17细胞数增加，而加入黏虫属黏虫血蓝蛋白（CCH）作为佐剂则安全且能进一步加强免疫反应。

5.3 其他DC细胞方案

Mehrotra等最近进行了一项I期临床试验以检测用3中不同A2-限制性肽加强的DC细胞的功用。使用hTERT（TERT572Y）、CEA（Cap1-6D）和生存素生产一个强化DC疫苗，并在胰腺癌的治疗中对其进行评价。治疗引起了特异性的T细胞反应，在50%的病人中达到了病情稳定状态。整体生存的中位数为7.7个月。该疫苗耐受良好，最常见的副反应为短暂的疲劳和流感样症状。

如上所述，在以hTERT为靶点的免疫疗法中未发现严重的不良事件。但是，在此免疫疗法中，可能有必要注意宿主免疫系统的异常。造血祖细胞以及B和T淋巴细胞都有很高的端粒酶活性。这意味着以hTERT为基础的抗癌症免疫疗法不仅杀死癌细胞也杀死这些具有很高端粒酶活性的淋巴细胞。之前使用hTERT来源的肽疫苗以及DC细胞试验，并没有关于淋巴细胞减少症的报告。但是，在使用稍后说明的治疗策略的未来的试验中应注意这些不良事件。

6.1 phTERT

可以使用通过重组DNA技术制得的编码hTERT肽的基因组来提高将表位递呈给T细胞的效果。通过基因枪或电穿孔可以将含有这些基因组的质粒输送到抗原递呈细胞。与肽疫苗相比，DNA疫苗成本效益更好。phTERT是一个经过优化的，合成hTERT全长序列的DNA疫苗。当通过电穿孔向小鼠和非人灵长类给药时，phTERT诱导了强力而广泛的hTERT特异性CD8⁺T细胞反应，其中包括表达CD107a、IFN-γ和TNF-α。此外，在接受免疫的猴子中产生了显著的IFN-γ以及抗原特异性的穿孔素释放，意味着phTERT可以克服免疫耐受并在人体免疫体内模型中引发强有力的细胞毒性。在此之前的一项使用HPV相关的肿瘤模型测定phTERT疫苗的预防及治疗效果，结果发现疫苗捡满了肿瘤增殖速率并提高了生存。

6.2 INVAC-1

INVAC-1是一个经过优化的编码hTERT失活形式的质粒，可以通过电穿孔经皮注射给药。在小鼠模型中，INVAC-1诱导了hTERT-特异性的T细胞反应，包括CD4⁺的Th1效应细胞和CD8⁺记忆性T细胞。在黑色素瘤模型中，INVAC-1导致了50%的生存率，与对照组相比显著延缓了肿瘤生长。

以细胞为基础的方案包括使用被慢病毒载体携带的hTERT基因永生化的人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）。通过这种技术生成的细胞具有很高的端粒酶活性，并且表达CD31、VEGF受体-2（VEGFR-2）以及整合素α5。在之前的一项试验中，通过辐射终止这些细胞的增殖并皮下接种免疫到患有肺癌和结直肠癌的小鼠体内。疫苗引发了体液和细胞免疫反应，意味着具有预防及治疗性抗肿瘤效应。

另一项方案则使用腺病毒作为载体。利用这项技术，使用经过甘露聚糖改造过的表达hTERT和VEGFR-2的开发出了一个混合疫苗。疫苗引发了强有力的抗肿瘤免疫反应并通过激活hTERT和VEGFR-2反应性的抑制了肿瘤间血管增生。

基因改造过的T细胞疗法是一种将对不同类型癌症具有特异性的T细胞运送到特定部位的疗法。使用的是经过基因工程改造产生了可识别肿瘤抗原及其表位的TCR的T细胞。最近，有两种开发基因改造T细胞的方法，其中一种是通过使用源自肿瘤特异性T细胞或其克隆的肿瘤特异性TCR，另一种则是使用嵌合抗原受体（CAR）。CAR的保外部分是一个单链形式的抗原识别受体，由一个能特异性识别肿瘤表面抗原的单抗的重链和轻链可变区组成，而CAR的胞内部分则是将TCR的胞内部分与共刺激分子结合而成。

TCR-工程化的T细胞（TCR-T）是通过利用能特异性识别肿瘤特异性抗原肽和主要组织相容性复合物分子（MHC）的TCR基因组改造T细胞而成。因此，TCR-T细胞仅在肿瘤细胞表达靶抗原表位和MHC分子时有效。如前所述，之前的实验表明很多癌细胞表达来自hTERT的表位。因此，以这些表位为靶点的TCR-T细胞可以有效地针对表达hTERT的肿瘤细胞。到目前为止的试验中，使用识别hTERT的TCR已经在免疫疗法中证明了其功用。

已经开发出了很多使用hTERT来源肽、DNA以及DC的免疫疗法，但其疗效目前仍不温不火。原因在于hTERT是一种自体抗原，而针对这种自体抗原发挥疗效的T细胞在体内很难诱导。此外，诱导出的T细胞的TCR亲和力低下，从而导致T细胞的抗肿瘤效果很弱。更要考虑到疫苗的抗肿瘤活性通常需要一些时间来发表，而这样的抗端粒酶疗法可能更偏向于紧急适应性免疫反应，诸如Hu等报道的端粒选择性延长机理。为了克服这一点，需要给药大量的含有能产生特定抗肿瘤疗效的TCR的T细胞。

如前所述，在癌症免疫疗法领域，已经在很多癌症类型中对TCR基因改造的T细胞疗法进行了尝试。在曲面未知的以hTERT靶点的免疫疗法中，TCR-T细胞疗法是最具前景的能在短期内发挥可靠的抗肿瘤疗效的疗法。另一方面，考虑到肿瘤位点会通过诸如PD-1的免疫检查点分子等机理造成免疫抑制，采用和免疫检查点抑制剂的联合疗法更为有效。

对癌症免疫疗法的研究导致了检查点抑制剂在临床上的广泛应用，而这其中几个重要的因素被反复强调。首先，宿主免疫系统的重要性，尤其是识别肿瘤抗原以及随后消除癌细胞的T细胞。其次，对于肿瘤位点由于缺乏诱导或浸润而缺乏能识别肿瘤抗原的T细胞的病人，检查点抑制剂可能疗效不佳。这些病人会需要诱导乃至于直接给药肿瘤特异性的T细胞，以帮助T细胞达到肿瘤。最近的试验则表明，作为肿瘤基因突变的产物，可以作为清除肿瘤细胞的有效靶点。但是，新生抗原不适于用做为通用抗原，因为它们因病人和癌症类型而异。另一方面，hTERT在大多数癌细胞中都有表达，从而可以作为更有效的癌症免疫疗法靶抗原。除此之外，仅使用单一类型的免疫疗法（例如，抗PD-1抗体或抗CTLA-1抗体）对于治疗实体瘤效果不佳。如此，近期的试验关注与对联合疗法的开发，诸如将检查点抑制剂和靶向药。诱导hTERT特异性反应的疗法在和检查点抑制剂、分子靶向药和/或其他类型的免疫疗法合用时疗效也会得到增强。因此，未来的研究会关注于包含hTERT特异性免疫疗法的复合治疗策略。

在众多肿瘤抗原中，端粒酶是一个具有吸引力的癌症免疫疗法靶点，因为hTERT是一个广泛存在于各种癌细胞中的靶点。正因为如此，到目前为止很多试验都关注于端粒酶为靶点的治疗策略的开发。近年来抗肿瘤免疫进步迅速，很多发现最近已经被应用于临床。但是，最近的证据还表明单一类型的免疫疗法不足以清除实体瘤。因此，有必要开发将不同类型免疫疗法、分子靶向药物以及化疗联合应用的新策略以改善癌症病人的预后。以hTERT为靶点的免疫疗法也包括在内，而这些工作也能在未来促进癌症疗法。