用于癌症治疗的抗体偶联药物（ADC）：策略、挑战和成功

一个多世纪前，德国医生和科学家PaulEhrlich提出了抗体作为选择性靶向恶性细胞的“魔法子弹”的概念。尽管如此，完全实现抗体的治疗潜力还是花了大约一百年的时间。Kohler和Milstein于1975年引入了杂交瘤技术，使得生产治疗性单克隆抗体成为可能。然而，这种单克隆抗体由于来源于小鼠，在人体中会产生免疫原性。重组DNA技术的出现使科学家能够生产工程化抗体，包括嵌合、人源化及全人源单克隆抗体（图1）。此后，多个针对肿瘤抗原的单克隆抗体被开发出来作为传统癌症化疗的替代方案。然而，大多数单克隆抗体单药治疗对癌症的治疗作用有限，因此通常与化疗联合使用。在过去的几年里，人们一直致力于通过对单克隆抗体进行各种修饰来改善其治疗活性。

图1  鼠源，嵌合，人源化和完全人单克隆抗体（单克隆抗体）的示意图。

一种很有前景的方法是将单克隆抗体和细胞毒性药物结合在一起，成为一个单分子实体，称为抗体药物偶联物（ADC）。ADC是一类新兴的抗癌药物，它将单克隆抗体的靶向性与小分子毒素的杀伤活性结合在一起，能够通过抗体–抗原相互作用增强肿瘤细胞中的特定，同时避免健康组织和/或细胞受到化疗损伤。图2显示了ADC的三个组成部分，包括肿瘤特异性单克隆抗体、有效的细胞毒素和稳定的连接子。这种三联分子作为一种强大的肿瘤杀伤药物，能够将高细胞毒性的小分子（也称为有效载荷或弹头）直接输送到癌细胞。

图2 抗体药物偶联物（ADC）的示意图。

尽管ADC的概念非常简单，但到目前为止，经过大约30多年的研究，只有三种药物获得批准上市，brentuxi单克隆抗体vedotin (Adcetris®,Seattle Genetics) 于2011年,trastuzu单克隆抗体emtansine (Kadcyla®Roche)于2013年,以及最近inotuzu单克隆抗体ozogamicin al(Besponsa®; Pfizer)于2017年，分别用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤（靶向CD30），转移性乳腺癌（靶向HER2）和B细胞前体急性淋巴细胞白血病（靶向CD22）。正如临床试验阶段结束后的ADC药物的数量所示，ADC令人满意的疗效比先前预期的更难实现，这突出了ADC开发的难度。本综述详细综述了ADC当前发展状况和前景展望；同时也讨论了ADC药物开发时，抗原靶点、有效载荷和连接子的选择所面临的挑战和潜在解决方案；以及针对特定位点偶联的单克隆抗体的选择和优化。

癌症的药物治疗可追溯到20世纪中期，人们发现氮芥通过靶向快速分裂的癌细胞来破坏个体的骨髓和淋巴组织。此类化疗药物包括叶酸和嘌呤类似物（甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤）、微管聚合抑制剂/促进剂（长春花碱和紫杉烷）和DNA破坏剂（蒽环类和氮芥）。这种化合物既作用于癌细胞，也作用于其他分裂细胞，因此接受治疗的患者会经历严重的副作用，大大限制了可使用的剂量。这些药物的治疗指数（最大耐受剂量/最小有效剂量）很小，导致治疗窗口狭窄。为了解决上述问题，人们做了许多尝试。ADC药物的前景就在于它能够将有毒化合物选择性地递送至癌细胞。

2.1 第一代ADC

在第一代ADC药物中，抗癌药物如丝裂霉素C、伊达霉素、蒽环素、N-乙酰麦法伦，阿霉素，长春花碱和甲氨蝶呤，主要通过不可降解的连接子与小鼠单克隆抗体结合。KS1/4-甲氨蝶呤和BR96-阿霉素是第一代ADC的代表；前者由鼠源单克隆抗体KS1/4通过酰胺键与甲氨蝶呤结合，用于治疗非小细胞肺癌，后者由一个嵌合的单克隆抗体BR96通过一个酸不稳定的腙键与阿霉素结合，用于治疗转移性乳腺癌。然而，对第一代ADC的体外和体内评价结果表明，这些ADC药物仅具有中等效能，而且往往比母体药物更低的活性。第一代ADC药物失败的原因可能有以下几点：

药物效力：患者血液循环中的药物浓度不在治疗范围内。

靶点抗原表达：由于肿瘤细胞仅表达少量抗原分子（稍后讨论），细胞内ADC递送的药物分子数量低于杀死细胞所需的阈值浓度。

ADC内化：进入细胞的实际ADC分子数量低于与细胞表面结合的分子数量。

肿瘤定位：患者肿瘤处放射性标记单克隆抗体的定位率较低（注射剂量/g肿瘤的～0.003–0.08%）。相比之下，小鼠异种移植肿瘤的累积率更高（注射剂量/g肿瘤的～15-20%）。

连接子稳定性：使用的连接子太稳定（导致低效和无效）或太不稳定（导致靶点特异性差和系统毒性高）。腙键的短半衰期（43小时）导致了由于过早的药物释放而引起的毒性。

免疫反应：早期ADC中使用的单克隆抗体是鼠源或嵌合体，导致免疫反应和人抗鼠抗体（HAMAs）的产生。

这些初步结果明确了第一代ADC中的关键问题。然而，Wyeth和tech通过开发Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin（Mylotarg®，辉瑞）改善了第一代ADC药物，它是由一种高活性的calicheamicin衍生物和一种低免疫原性的抗CD33人源化单克隆抗体结合而成。尽管其在临床上表现出了良好的活性，并于2000年获得FDA的批准，但随后的临床数据引发了对安全性和临床结果的担忧后，Gemtuzu单克隆抗体Ozogamicin随后退出了市场。Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin存在几个潜在的缺点，包括连接子缺乏稳定性（48小时释放50%的结合药物）、使用的calicheamicin具有高疏水性、存在50%的未结合单克隆抗体、差的CMC特性以及高毒性。此外，细胞通过外排泵、多药耐药蛋白1（MDR1）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）从细胞中清除了Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin。

2.2 第二代ADC

从第一代ADC中汲取的经验教训促使了第二代ADC的发展。有以下几个原因：在过去的15年里，单克隆抗体技术不断改进；单克隆抗体对肿瘤细胞的选择性越来越高，与正常细胞的交叉反应越来越少。更重要的是，早期使用抗癌药物作为有效载荷的ADC缺乏临床成功，促进了更高活性分子（100-1000倍）的出现。与第一代ADC相比，第二代ADC具有更好的CMC特性。FDA批准的三种ADC药物：Brentuxi单克隆抗体vedotin、ado-trastuzu单克隆抗体emtansine和Inotuzu单克隆抗体ozogamicin，反映出了第二代ADC药物的研发成就，显示出令人印象深刻的临床疗效和安全性。

然而，由于脱靶毒性、与未结合抗体的竞争以及药物抗体比（DAR）为8引起的ADC聚集或快速清除等原因，目前大多数第二代ADC显示出较窄的治疗窗口。第二代ADC有着不同的DAR值分布（DAR=0-8），平均DAR为3.5（例如，trastuzu单克隆抗体emtansine）或4（例如，brentuxi单克隆抗体vedotin）。大约有5%的未结合抗体与ADC竞争结合抗原，尽管这对Brentuxi单克隆抗体vedotin和trastuzu单克隆抗体emtansine（含有5%的未结合物种）似乎没有问题，但对于50%未结合抗体的gemtuzu单克隆抗体ozogamicin来说，未结合抗体的存在，问题更为明显。此外，DAR>4的ADC被证明具有较低的耐受性、较高的血浆清除率和较低的体内疗效。

2.3 第三代ADC

在过去的十年中，第一代和第二代ADC的经验教训现在被用于第三代ADCs的开发。单克隆抗体的优化、连接子和偶联工艺的优化可以提高第三代ADC的治疗指数。位点特异性偶联被认为是ADC成功开发的关键，保证了确定的DAR值及ADC的均一性。MEDI4276（抗HER2双表位单克隆抗体（靶向同一靶标上的两个不同的非重叠表位）通过马来酰亚胺与四个微管抑制剂偶联）、vadastuxi单克隆抗体taliline（抗CD33单克隆抗体与PBD二聚体通过酶可裂解的连接子偶联）和IMGN779（抗CD33单克隆抗体与三个吲哚并苯并二氮通过可裂解的二硫键连接子偶联）分别代表了第三代ADC产品。

第三代ADC利用小分子药物与工程单克隆抗体的位点特异性结合，产生的ADC的DARs为2或4，这种ADC药物没有增加的全身毒性，无未结合的单克隆抗体，稳定性和药代动力学得到改善，具有更低的偶联脱落速度，更高的药物活性以及低抗原水平下的高细胞活性。

ADC的成功取决于四个因素：（a）靶抗原，（b）抗体特性，（c）小分子药物活性和（d）偶联策略。

3.1  靶点选择

ADC的成功开发依赖于选择合适的靶点抗原，ADC的单克隆抗体部分可以与之结合。因为细胞表面抗原靶标的数量有限，而抗原–抗体复合物的内化过程通常效率低下，所以，抗原的选择具有一定挑战性。靶点抗原选择需要考虑几个因素：为了减少脱靶毒性，为ADC提供可接受的治疗指数，靶抗原应在肿瘤中的表达水平较高，在正常组织中的表达很少或不表达，或仅在特定组织类型中有表达。然而，在肿瘤细胞表面很少有完全特异性抗原（肿瘤特异性抗原），大多数ADC靶点往往是肿瘤相关抗原。值得注意的是，除非这些细胞对药物作用不敏感，否则正常细胞上此类抗原的表达应保持在最低水平。正常细胞中靶点抗原的表达会导致靶外ADC的摄取，进而产生毒性并降低了肿瘤治疗的ADC使用剂量。目前在临床试验研究中发现了一些有希望的抗原，这些抗原在一种或几种实体瘤的相对特异性表达，包括CD138（在多发性骨髓瘤和多种实体瘤中表达）、5T4（在大多数实体瘤的细胞表面表达）和间皮素（在胰腺癌和卵巢癌中表达）。重要的是，在血液肿瘤中也发现了一些潜在的有希望的靶点，包括白血病表面抗原和CD37。

有效的ADC活性所需的抗原表达水平根据不同抗原特性而变化。ADC需要至少10⁴个抗原/细胞，以确保能够递送致死数量的细胞毒性药物。理想情况下，ADC的抗体部分所针对的抗原应在肿瘤细胞表面均匀表达且拷贝数较高（>10⁵/细胞）。肿瘤细胞表面通常只有有限数量的抗原（大约5000到10⁶个抗原/细胞），当前临床阶段得大多数ADC的平均DAR为3.5-4，因此ADC输送到肿瘤细胞的药物量很低。如上所述，这也被认为是使用传统细胞毒性药物（如甲氨蝶呤、紫杉醇类和蒽环类药物）的ADC临床失败的主要原因之一。除了特异性和足够的表达量外，最佳靶抗原还应该诱导有效的ADC内化。与靶细胞表面抗原结合的抗体可触发抗体–抗原复合物进入细胞，从而实现毒素药物的细胞内传递。

综上所述，理想的肿瘤抗原需要在癌细胞中高度表达，定位于细胞表面，在ADC结合后有效内化，并在细胞内能够释放细胞毒药物。

3.2 抗体选择

ADC药物所需抗体分子的基本要求是优先结合靶细胞上的抗原，从而将细胞毒药物浓缩在肿瘤部位。抗体应该以高亲合力选择性地与肿瘤细胞结合，并且与正常细胞几乎没有交叉反应。缺乏肿瘤特异性的抗体，因免疫原性从血液循环中清除后，除了对正常细胞有毒外，还会导致次选的靶标的暴露和治疗效果的降低。因此，细胞毒性药物通常与单克隆抗体的Fc部分连接，以免干扰抗原的结合和检测时产生干扰。

所有目前处于临床试验中的ADC都使用了人IgG分子，因为这些分子量达150kDa的生物分子不仅含有多个天然位点用于偶联，而且还可以通过修饰产生其他偶联位点。一般而言，IgG分子因其对靶点抗原的高亲合力和血液中长循环半衰期，导致肿瘤部位的累积增加。然而，与单克隆抗体类似，大多数ADC选择IgG1，原因如下：①不同的IgG亚型有不同的Fc免疫功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。与IgG4和IgG2亚型相比，人IgG1和IgG3有更强的ADCC和CDC。人IgG4还具有抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。然而，一些研究人员认为在细胞毒性药物上存在ADCC活性可能会导致毒性太大。值得注意的是，在已批准的ADC中，免疫效应功能与否与其体内抗肿瘤活性密切相关。例如，基于IgG1亚型的BrentuximabVedotin，比基于IgG4亚型的GemtuzumabOzogamicin显示出更好的活性。②尽管在肿瘤细胞裂解方面有效，但与IgG1,2和4相比，IgG3抗体的短半衰期和快清除率使它们不能成为用于ADC的选择。③ 另一方面，IgG4抗体也不是优选的，因为IgG4会发生Fab臂交换，可能形成新的杂合IgG4。为了克服这一点，可以用IgG1的CH3区替换IgG4的CH3区。④IgG2因含有四个链间二硫键（IgG1和IgG4仅有两个）提供了结合更多细胞毒素的理论可能性，但IgG2和IgG4铰链比IgG1更难还原，因此，基于半胱氨酸的ADC更难以产生；同时，IgG2具有独特的二硫键异构结构和更复杂的铰链区。所以，IgG1被更多的选择用于ADC的开发。

大多数ADC开发依赖于抗体的内化作用。通过免疫荧光显微镜分析发现，ADC和裸抗之间的内化效率是可以发生变化的，从而影响了药物在肿瘤和正常细胞中的摄取及释放。在某些情况下，二者都以相同的速率内化，而在其他情况下，ADC有更高内化效率。虽然对ADC的作用机制来讲，内化是必要的，但定位于细胞外环境的ADC也可以在靠近肿瘤细胞的位置释放药物。实际上，ADC内化可能不是有效ADC的绝对要求，如CD20，CD21和CD72等非内化抗原，含有不稳定连接子的ADC药物能有效治疗，而含稳定连接子的则无有效治疗作用。实际上，药物在肿瘤细胞外环境中的局部释放可能足以对癌细胞造成损害，但局部药物释放取决于ADC在肿瘤部位的停留时间和连接子的性质。

ADC的免疫原性是其循环半衰期的主要决定因素之一。早期的ADC利用鼠源单克隆抗体诱发人类强烈的免疫反应，导致单剂量2周内HAMAs迅速形成。从那时起，鼠源单克隆抗体逐步被嵌合，人源化或全人源单克隆抗体取代。目前在临床开发中的大多数ADC均使用人源化或全人源抗体，而针对被识别为半抗原的细胞毒性药物的抗体的形成较为少见。

综上所述，用于ADC开发的理想单克隆抗体应该是人源化或全人源单克隆抗体分子，其能够选择性地结合肿瘤细胞而与对正常细胞没有交叉反应。此外，ADC内化可能是成功治疗的重要因素，但不是绝对因素。

3.3 细胞毒性有效荷载选择

细胞毒性药物（小分子，有效荷载或弹头）是影响ADC活性和特征的关键因素。用于ADC开发的细胞毒性药物必须满足以下几点，很强的细胞毒性，在肿瘤细胞中释放原始药物的适当修饰位点，偶联后保持活性，可接受的水溶性，水性制剂和生理条件下的稳定性，以及明确的作用机制。此外，药物应在良好生产规范（GMP）的条件下合成获得，并且成本可控。大多数细胞毒性药物是疏水性的，并且倾向于诱导抗体产生聚集。所以，为保证较长的保质期，并限制快速清除率和免疫原性，应关注细胞毒性药物的疏水性问题。

目前用于ADC研究和开发的有效荷载具有比第一代ADC更大的效力，并且通常可分为两大类：微管抑制剂和DNA损伤剂。其他小分子，如α-鹅膏毒素（一种选择性RNA聚合酶II抑制剂）也在研究中。

有丝分裂抑制剂能够干扰有丝分裂，染色体纺锤体分离，改变细胞的细胞骨架结构，导致细胞死亡。用于ADC开发的两种最广泛使用的有丝分裂抑制剂基于auristatin或maytansinoids。两种类型的有效荷载代表微管组装的有效抑制剂，在长春碱结合位点附近与微管蛋白结合，引起G2/M细胞周期阻滞和随后的细胞凋亡。这种细胞杀伤机制在快速增殖的细胞中非常有效，但非分裂和静态细胞可能对药物作用不太敏感，导致产生耐药性。因肿瘤细胞分裂速度比大多数正常细胞更快，所以抗有丝分裂药物对癌细胞特别有效。由于这种固有的选择性，高效的微管蛋白抑制剂，如美登素（DM1和DM4）和auristatin（MMAE和MMAF），已成功用作临床批准的ADC药物（brentuximabvedotin和trastuzumabemtansine）。auristatin和maytansinoids也是目前临床试验中大部分ADC使用的有效荷载（表1）。

DNA结合细胞毒素通过与双螺旋小沟中的DNA结合而发挥其细胞毒性作用。Calicheamicins，duocarmycins，camptothecins，anthracyclines，pyrrolobenzodiazepines（PBD）和indolinobenzodiazepines是这类细胞毒性药物的代表，所有这些都显示出高效的活性。这种小分子倾向于与DNA的小沟结合并促进DNA链烷基化，断裂或交联。N-乙酰-γ-卡里奇霉素，通常用作ADC结构中的DNA损伤剂，用于gemtuzumabozogamicin和inotuzumabozogamicin。值得注意的是，由于Calicheamicin疏水性较强，为避免聚集蛋白，每个单克隆抗体只能偶联几个分子。除了上述细胞毒性有效荷载外，其他被研究的分子还包括pyrrolobenzodiazepines[(PBDs), SGD-1882]，doxorubicin和centanamycin（indolecarboxamide）的衍生物，它们都能够与DNA结合并烷基化或嵌入DNA中。

综上所述，ADC结构中使用的所有细胞毒性化合物具有以下特性：①与标准化学治疗药物相比，具有显着更高的毒性效力（IC50值在0.01-0.1nM范围内），②可通过诱导细胞凋亡杀死癌细胞，③存在适合与抗体连接的官能团（这对于在不过度改变单克隆抗体行为的情况下实现充分的药物荷载特别重要），④可接受的水溶性能够与抗体反应，⑤并且在常用的抗体制剂中有较好的稳定性。

3.4  连接子选择

开发有效ADC的最大挑战之一是选择合适的连接子。将细胞毒性药物与单克隆抗体连接的连接子是ADC的核心部分，以保证其在血液循环中的稳定性。连接子必须能够在靶细胞内或其附近以活性形式释放细胞毒性药物。连接子是ADC有效递送细胞毒性药物的基础，也是决定ADC产物毒性的关键因素。循环中药物的过早释放可导致全身毒性和较低的治疗指数。连接子的选择通常依赖于靶标，药物，抗体–抗原复合物的内化和降解情况，以及所用药物的性质等。

药物释放的机制是连接子选择中的重要考虑因素。目前正在临床评估的大多数ADC含有通常可分为两大类的连接子：可裂解和不可裂解的连接子。二者均已用于经批准的第二代ADC和第三代ADC，目前正在临床试验中进行研究。

可裂解连接子利用了血液循环和癌细胞内之间的条件差异。低pH（酸性环境），蛋白酶水解（溶酶体中存在某些特定蛋白酶）和还原环境（细胞质的高谷胱甘肽浓度）是用于肿瘤细胞内药物释放的一些细胞内特征。基于上述标准，有三种类型的可裂解连接子：腙键，二硫键和肽类接头，每种连接子都响应不同的肿瘤特异性细胞内条件。

另一方面，不可裂解连接子依赖于抗体在溶酶体内完全降解。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子只能在进入到靶细胞内后释放药物。所以，具有不可裂解连接子的ADC必须求适当的内化和细胞内降解才能起作用。硫醚连接子是不可裂解连接子的最常见的例子。

综上所述，在血液循环中的几天内，连接子稳定性以及在递送到靶细胞后的有效裂解，有效的连接子设计时应当考虑。

表1 已批准上市和处于临床试验阶段的ADC药物

将连接子毒素连接到抗体分子的偶联步骤是影响ADC治疗潜能的关键因素。偶联过程不应改变抗体的完整性，与抗原的结合力，效应功能（若有），以及药物的生物活性。同时，偶联过程应保持单克隆抗体和细胞毒性药物的天然形式，使产品在水溶液中储存或冻干/灭菌过程中保持完整，并保证产品批次的可放大性和产品性质的均一性。

尽管一些较早的ADC是基于抗体上糖基部分的修饰而开发的，但目前在临床试验中研究的大多数ADC的偶联过程依赖于药物与抗体中氨基酸残基的连接。理论上，通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。然而，赖氨酸残基的亲核性伯胺基和半胱氨酸的反应性硫醇基是最常用的氨基酸，它们仍然是目前最常用的方法。这些方法包括还原的链间二硫键的烷基化，可及赖氨酸侧链胺的酰化和基因工程半胱氨酸的烷基化。

赖氨酸是最常用的将底物与抗体连接的氨基酸残基之一，它们通常暴露在抗体表面上，易于获得。IgG分子具有超过80个赖氨酸残基，其中溶剂可及性高的位点超过20个，而这些氨基酸均可被酰化，所以这些位点的偶联导致异质混合物的产生。从数个赖氨酸偶联的ADC药物中，上述提到的gemtuzumabozogamicin是第一个被批准上市的ADC药物。

将细胞毒药物偶联到单克隆抗体链间半胱氨酸残基的硫醇基上是另一种最常用的偶联方法。与赖氨酸相反，IgG序列内的半胱氨酸残基数量少得多，一个IgG中有16个二硫键，12个链内，4个链间二硫键。由于更高的溶剂可及性，4个链间二硫键是偶联的潜在位点。这可以显着降低ADC的异质性，以及比基于赖氨酸的ADC更高的均一性。

通过基因工程位点的位点特异性偶联可以实现更均一的ADC，能在特定位点实现细胞毒素的连接。该概念首的引入是通过将天然IgG1铰链区得8种半胱氨酸中的2个或4个突变为丝氨酸来实现的。使用基因重组方法将半胱氨酸被特异性地引入单克隆抗体骨架中，可得到更均一的ADC偶联物。

轻链和重链上的工程化半胱氨酸取代提供了反应性硫醇基，并实现位点特异性药物偶联（THIO单克隆抗体drug conjugates;TDCs）。事实上，第一代TDC在循环系统中表现出较高的偶联脱落率；这是由于马来酰亚胺与血液中的白蛋白，游离半胱氨酸或谷胱甘肽中存在的反应性硫醇发生交换所致。但这种高脱落率在下一代TDC中得到了成功解决，因为具有带正电环境的可接近位点导致连接子中琥珀酰亚胺环的水解增加，进而阻止这种交换反应。

除了TDC之外，还有多种技术实现位点特异性偶联来增加同源ADC。这些方法包括：工程化的N-末端丝氨酸，结合Fab核苷酸结合位点，天然半胱氨酸重配，避免逆–迈克尔去偶联，工程半胱氨酸，酶促偶联（FGE，transglutaminases或sortases），糖链重塑和糖基偶联，非天然氨基酸（如硒代半胱氨酸）和UV交联等。

ADC诱导细胞凋亡的机制可归纳如下：（1）ADC内化，（2）内化的ADC的细胞内运输，和（3）ADC活化成细胞毒性化合物（图3）。为防止胃酸和蛋白酶对单克隆抗体的水解，ADC药物通过静脉注射到血液中，ADC 通过内皮中的毛孔外渗或通过内皮细胞的胞饮作用分布到癌组织中。ADC的单克隆抗体部分使其能够在血液中循环，直至发现并结合到靶癌细胞上存在的肿瘤特异性细胞表面抗原。与具有单层内皮细胞彼此形成紧密连接的正常血管不同，肿瘤内皮相对松散，导致单层渗漏。因此，ADC的大分子性质不能定限制它们在肿瘤组织中的分布，而使它们在代谢和消除器官中的分布最小化，例如肝，肠，肌肉和皮肤，从而延长它们的半衰期。

图3 ADC作用机制

如图3所示，ADC的细胞毒性的主要作用机制是它们的内化。ADC可以通过三种不同的内化途径内化，包括网格蛋白介导的内吞作用（ADC的细胞内摄取的主要途径），细胞膜穴样内陷介导的内吞作用和胞饮作用。前两种类型的抗体内化是抗原介导的，而最后一种是抗原非依赖性的。已上市或晚期临床试验中的所有ADC均靶向位于网格蛋白包被的凹陷或脂筏上的抗原，这说明这些ADC需要在结合时抗体内化。内化的速度和效率取决于靶标的类型和细胞毒素的选择。无论配体结合与否，有些靶标经常性的发生内化，而有些靶标则只位于细胞表面。

如图3所示，ADC结合并内化后，进入溶酶体途径，先进到早期胞内体，后成为晚期胞内体，最终失去循环利用的能力，晚期胞内体与溶酶体融合，pH降低，富含酸性和蛋白酶的溶酶体降解抗体骨架，从而导致游离细胞毒的最佳释放;有效荷载可以在细胞质中自由循环，干扰细胞机制，最终诱导细胞死亡。然而，并非所有细胞表面抗原都会发生内吞作用，内化速度也可以从快速变为零。另外，一些抗原的内化效率取决于单克隆抗体的结合表位和不同水平的抗原–抗体亲和力。虽然最初认为靶向非内化抗原的ADC效果不佳，但有研究表明，与非内化抗原CD20结合后，与oxorubicin/auristatin结合的利妥昔单抗可以有效的内化。但当相同的利妥昔单抗与calicheamicin结合时，情况并非如此。当比较ADC与裸抗的内化率时，发现与裸抗相比，ADC-抗原复合物有着同样的或甚至更有效内化效率。

此外，ADC通过其人源化IgG抗体的Fc部分与人FcRns的受体的结合来延长半衰期的机制如图3所示。FcRn-ADC复合物可以被输送回体循环或输送到肿瘤细胞周围的间质液中。由于内皮细胞内FcRns的浓度非常高，ADC转运出细胞非常有效，这可防止ADC导致不必要的内皮细胞死亡。然而，ADC与肿瘤细胞FcRns的过度结合可能会限制药物释放并阻止ADC的活性。总之，需要最少的ADC再循环到细胞表面，以及增强的抗原/ADC内化至溶酶体的递送，以保证毒药物最大限度地在肿瘤细胞中释放。

如果释放的药物（或–连接子药物组合物）是可渗透的，它会根据药物类型及其物理化学特性进入并杀死相邻细胞，这种现象称为“旁观者效应”（BYSTANDER）。

实体肿瘤目标抗原的表达通常是异质性的，因此，ADC可能无法直接有效地杀伤邻近的抗原阴性癌细胞。但ADC不仅可以杀死抗原阳性细胞，还可以通过旁观者效应杀死附近的其他细胞。当ADC药物在细胞外空间或靶细胞内释放细胞毒素后，会发生基于旁观者的杀伤（图4）。在这两种情况下，不管他们是否表达ADC靶抗原，药物均可以从靶细胞扩散并杀死周围细胞。药物通过被动扩散、死亡细胞泄漏或主动转运离开细胞。

图4 ADC的旁观者效应

值得注意的是，旁观者效应还破坏了支持肿瘤生长的结构，如肿瘤基质细胞和肿瘤血管，从而导致抗肿瘤作用增强。一些研究报道了ADC的旁观者效应，包括huC242（抗CanAg人源化单克隆抗体）通过可还原的二硫键与美登素偶联，以及抗体通过二硫键连接美登素偶联物。

可裂解的连接子有可能产生中性药物，可以更容易地穿过细胞膜并杀死周围的细胞。相反，使用不可裂解的硫醚连接子未观察到旁观者效应，这是由于不可裂解的连接子分解形成的氨基酸–连接子–细胞毒素复合物带正电荷，不能穿过靶细胞的疏水性脂质双层所致。药物的局部释放取决于ADC在肿瘤部位的停留时间和连接子的性质。除连接子外，细胞毒性药物在旁观者效应中也起重要作用。例如，MMAE是中性的并且能够穿过生物膜，而MMAF产生具有带电荷的羧基末端苯丙氨酸残基的代谢物，不能通过生物膜，所以，MMAF对邻近细胞的毒性低于MMAE。

癌细胞常常通过上调MDR1的表达而对药物产生耐药性。已显示具有非带电荷或非极性连接子的基于美登素类的ADC对MDR1阳性细胞的体外效力低于对MDR1阴性细胞的体外活性。已知MDR1转运疏水性化合物比亲水性化合物更有效。因此，人们开发了带电荷或亲水性连接子，并且证明此类ADC裂解产生的高电荷或极性代谢物，能改善对MDR1阳性细胞的活性。但带电荷的连接子–药物代谢物不能穿过生物膜，所以，旁观者效应有限，但对抗多药耐药的癌细胞具有更强的抗肿瘤活性。N-羟基琥珀酰亚胺基-4-（2-吡啶基二硫代）-2-磺基丁酸酯（sulfo-SPDB）和mal-PEG4-N-羟基琥珀酰亚胺是极性连接基团的代表。

 综上所述，ADC介导的旁观者效应在很大程度上取决于以下因素，例如结合靶抗原后ADC内化的程度，不可裂解或可裂解连接子的存在，以及偶联的细胞毒性药物的疏水性。

自2013年以来，ADC领域变得非常活跃。超过30个额外的ADC进入临床开发阶段，目前处于临床试验开发阶段的中ADC超过60个，其中I期临床试验约占70％。正如临床开发中快速增长的ADC候选药数量所显示的那样，最近的临床结果引发了ADC开发显著地的更多兴趣。表1显示了目前处在临床试验早期和晚期阶段中的ADC药物。

使用单克隆抗体和小分子的癌症靶向治疗已迅速成为目前使用的主流方法。在过去的十年中，特别是在三个ADC获得批准之后，ADC技术的发展取得了令人震惊的进展，并促使了一系列针对ADC的研究和开发。ADC通过利用肿瘤靶向单克隆抗体的特异性和稳定性以及先进的连接子药物组合的稳定性和高活性，正在彻底改变癌症治疗领域。大多数ADC使用两种有效的微管蛋白抑制剂，maytansinoids和auristatins。重要的是，连接子药物化学的进步（血浆稳定性的提高和肿瘤部位细胞毒素的可控释放），使现代ADC技术得到了关键性的应用。对影响ADC活性的参数的优化促进了新的细胞毒性药物、单克隆抗体和连接子的开发，这些药物可以被设计或合成来生产有效的ADC。最近的第三代位点特异性和均一偶联ADCs的临床前评估结果为ADC领域带来了信心和乐观的前景。然而，对于ADC在癌症治疗中的最佳应用，显然还有很多事情要研究。高活性的药物、稳定的连接子、优化的药物化学计量以及选择合适的抗原靶点，是推动这项技术发展到今天的关键。

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