​瑞舒伐他汀钙片体内外一致性评价研究

药学与临床研究 2019 Dec;27(6)

微信来源：

李 攀，薛敏华，唐 婉，石蓓佳，杭太俊，陆益红

中国药科大学药物分析系

江苏省食品药品监督检验研究院

徐州医科大学药物分析教研室

目的：

通过体外溶出试验和体内生物等效性试验，考察瑞舒伐他汀钙仿制制剂与参比制剂的质量与疗效，同时采用GastroPlus^TM进行群体药代动力学模拟，评估软件模拟预测的性能可靠性。

方法：

分别测定不同 pH 缓冲液（pH 1.0～8.0）中瑞舒伐他汀钙的溶解度；测定仿制制剂与参比制剂在 pH 1.0 盐酸溶液、pH 4.5 醋酸盐缓冲液和 pH 6.6 枸橼酸盐缓冲液等 3 种溶出介质中的溶出曲线；采用 f2 因子法评价溶出曲线相似性。

在 28 名健康成年中国志愿者中进行临床 BE 试 验，评估两制剂的生物等效性。

通过GastroPlus^TM进行 PK 建模，在虚拟的 28 名健康成年中国人中进行群体药代动力学研究，将临床 BE 试验结果与GastroPlus^TM模拟结果比较，验证虚拟生物等效性研究的可行性。

结果：

溶解度结果显示，瑞舒伐他汀钙属于高溶解性药物。

体外溶出结果显示，仿制制剂与参比制剂在 pH 1.0 介质中，除批号 170703 的 f2 因子为 49，其他批号的 f2 因子均＞50，两者基本相似；在 pH 4.5 介质中 f2 因子均＜50，溶出曲线不相似；在 pH 6.6 介质中，两者在 15 min几乎完全溶出（> 85％），溶出曲线相似。

临床试验和软件虚拟预测 BE 结果均显示 Cmax 和 AUC 的几何平均比（仿制/参比）的 90％ CI 在 80％～125％的范围内，仿制制剂与参比制剂生物等效。

结论：

仿制制剂与参比制剂生物等效，软件模拟 BE 可以用于仿制药一致性评价临床前的初步研究。

瑞舒伐他汀钙；溶出曲线；生物等效性；GastroPlus^TM；虚拟群体药代动力学

开展仿制药一致性评价，保障仿制药在质量和疗效上与原研药一致，在临床上实现与原研药相互替代，不仅可以节约医疗费用，也有助于提升我国仿制药质量和制药行业的整体发展水平，保证公众用药安全有效。

仿制药能替代原研药在临床上使用的前提，是仿制制剂与指定的参比制剂药学等效（Pharmaceutical equivalence，PE）和生物等效（bioequivalence，BE），以此证明仿制制剂具有与参比制剂相同的质量和疗效。

对于固体口服制剂 PE 的重要组成部分是考察仿制药和原研药在多种不同 pH溶出介质中的溶出行为的相似性，这是对口服固体制剂内在质量评价的最主要方法。

然而，体外溶出曲线相似性评价仅模拟表征了药物在胃肠道中的释放和溶解过程，虽然可以提高仿制药生物等效的可能性，却难以准确地表征药物在体内的真实过程，因此，需要进行 BE 研究以确保仿制药与原研药疗效的一致性。

软件模拟被广泛地应用于药物体内药代动力学的研究[1]，它可以为体内外相关性研究、BE 试验的设计提供帮助。

本文采用的GastroPlus^TM软件内置了独有的高级房室吸收与转运模型（advanced compartmental absorption and transit model，ACAT），它按生理学特征将胃肠道分为 9 个房室，考虑了药物在胃肠道中的 6 种状态，可以构建药物特异性胃肠道吸收模型[2，3]。

其基于生理学的药代动力学（physiologically based pharmacokinetic，PBPK） 模 型 考 虑了解剖学和生理学以及药物和制剂的物理化学性质，描述了药物吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程[4，5]。

将药物的理化性质参数输入到 ACAT 模型用于表征药物的胃肠道吸收和转运 ，建 立 药 物 的PBPK 模型用于表征药物的处置过程，将药物的体外溶出曲线导入到软件中，以评估制剂的溶出行为对药物体内过程的影响；因此，结合体外溶出曲线相似性评价，同时采用计算机软件模拟技术的建模，可以模拟药物在体内的过程[6]。

瑞舒 伐 他 汀 钙（Rosuvastatin Calcium）为 3-羟 基-3-甲基戊二酰辅酶 A（HMG-CoA）还 原 酶 抑 制剂，由日本盐野义制药株式会社于 20 世纪 80 年代末合成，后由英国阿斯利康公司开发研制，临床用于调节血脂。

国内已有多个厂家对瑞舒伐他汀钙片进行仿制[7-9]。

从体外溶出曲线研究和体内生物等效性评价两个方面系统评价国产瑞舒伐他汀钙片，关于这方面的研究，尚未见文献报道。

本研究结合瑞舒伐他汀钙的 BCS 特性，使用体外溶出曲线和GastroPlus^TM评估瑞舒伐他汀钙片国产仿制制剂与参比制剂的生物等效性，并与临床试验结果对比，验证模拟 BE 的可行性，以及软件评估的可靠性，为仿制药的一致性评价提供参考。 

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1.1 仪器

Sciex API 5000 三重四级杆质谱仪 （配有 ESI源及 Analyst 定量处理软件，美国 Sciex 公司）；岛津LC20 高相液相 色 谱 仪（SPD-M20A，日 本 Shimadzu公司）；AT7 smart 自动溶出仪（瑞士 Sotax 公司）；ZKT-18F 真空脱气机 （天津天大天发科技有限公司）；XSE205 十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence 多参数测定仪 （瑞士梅特勒-托利多公司）；0.45 μm 针头滤膜 （PES 和尼龙，上海安谱实验科技股份有限公司）。GastroPlus^TM（版 本 9.5.0004，Simulations Plus，Inc.，Lancaster，CA，USA）。

1.2 药品与试剂

参比制剂（R）瑞舒伐他汀钙片（规格 10 mg，批 号 131343、131347、131358，AstraZeneca UK Limited 公司）；仿制制剂（T）（规格 10 mg，批号 171701、170702、170703，A 制药公司）；瑞舒伐他汀钙对照品（纯度 97.6%，批号 101028-201202，中国食品药 品检定研究院）；瑞舒伐他汀钙-d6（纯度 98.65%，批号2-WEN-131-1，加拿大 TRC 公司）。

盐酸、氢氧化钠、柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物、乙酸钠、冰醋酸、磷酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck KGaA 公司）；甲酸 （色谱纯，美国 AnaquaChemical 公司）；溶出介质试验用水：超纯水，均采用脱气装置经 40 ℃脱气 30 min 后立即使用。

2.1 体外溶出曲线相似性评价

2.1.1 pH-溶解度曲线的测定 

将过量的瑞舒伐他汀钙分别加入 pH 值为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的缓冲液中，在 37 ℃振摇 24 h，使成饱和溶液，滤过，取续滤液适量，用 25%乙腈适宜倍数稀释后采用 HPLC 法[10]测定峰面积，按外标法计算溶液中瑞舒伐他汀的含量，从而确定在不同 pH 值缓冲液中瑞舒伐他汀的饱和溶解度。

当释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的至少 3 倍量时，认为满足漏槽条件[11]，可作为体外溶出相似性评价的介质。

比较进口注册标准（JX20030283）[12]，瑞舒伐他汀钙片的溶出度检查项下溶出介质（pH 6.6 枸橼酸盐缓冲液）、健康人体胃中生理液 pH（0.1 mol·L^-1盐酸溶液）以及“普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则”[10] 推荐的溶出介质（pH 4.5）。

参照“普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则”[13]，最终选择 0.1 mol·L^-1盐酸（pH 1.0）、pH 4.5 醋酸盐缓冲液、pH 6.6 枸橼酸盐缓冲液作为溶出介质，对两制剂进行溶出曲线研究。

取仿制制剂（T）和参比制剂（R）各 3 批（n=12），照溶出度与释放度测定法（《中国药典》2015 年版通则 0931 第二法）分别以 3 种介质 900 mL 为溶出介质，转速为 50 r·min-1，依法操作，在 5、10、20、30、45、60 min 时，分别取样 10 mL 并及时补液。

将取出的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取瑞舒伐他汀钙对照品适量，加溶出介质并定量稀释制成每毫升中约含 10 μg 的溶液作为对照品溶液，参照瑞舒伐他汀钙片进口注册标准（JX20030283）[12]溶出度项下的色谱条件测定，色谱条件为：色谱柱：Waters X-Bridge C18（4.6 mm × 150 mm，3.5 μm）；流动相：磷酸-水-乙腈（1∶600∶400）；检测波长：242 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。

典型色谱图如图 1 所示。

2.1.3 数据分析 

当仿制制剂和参比制剂在 15 min时的平均溶出量均不低于 85％时，认为两者的溶出曲线相似；否则，用相似因子（f2）法比较溶出曲线相似性[14]。

当 f2 值不小于 50 时，认为两条溶出曲线相似，否则认为不相似[14，15]。以下等式定义 f2：

其中 Rt 和 Tt 表示在时间点（t）的参比和仿制制剂的平均溶出百分数，n 是比较平均溶出时间点的数量。

2.2 体内药代动力学研究

2.2.1 研究对象 

依据 CFDA 最新颁布的“生物等效性指南”对生物等效性试验入组受试者性别的建议：研究将拟用于两种性别的人群；且 FDA 关于瑞舒 伐 他 汀 钙 的 Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review 中一则生物等效性试验所用受试者例数为 31 例，另一则为 32 例。

参考以上情况，试验拟入组 30 例健康受试者，实际入组 28 例，男性 18例，女性 10 例，20~43 周岁，体重不低于 50 kg，体重指数（BMI）在 19.0~26.0 kg·m^-1，无吸烟、嗜酒史，全面体检各项指标均正常。

受试者试验开始前 3 个月内未参加其它任何药物临床试验，且 6 周内未服用任何药物。受试者本人签署知情同意书，并经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会审批同意。受试者随机分为 2 组，禁食 10~12 h 后，空腹口服 仿 制 制 剂 （批 号 170701） 或 参 比 制 剂 （批 号131343）1 片，用 250 mL 温开水吞服药物，受试者口服药物前 0 h（服药前 0.5 h 内）和服药后 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0 h 分别于肘静脉取血约 2.5 mL，分别置于含 EDTA-2K 抗凝试管中，试管提前置于冰上预冷。

4 ℃、3 000 r·min^-1离心 10 min。

吸取上层血浆，-80 ℃保存，供血药浓度测定用。

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2.2.2 分析方法

以瑞舒伐他汀钙-d6 作为内标，100 μL 血浆样品经甲醇沉淀蛋白，采用经过验证的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法检测血浆样本中瑞舒伐他汀的浓度。

色谱条件：色谱柱：SunFire^TMC18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流动相 A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液 [梯度：0~2 min （35% B~70% B）；2.05~3.50 min（95% B~95% B）；3.55~5 min（35% B~35% B）]；流速：0.6 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：采用大气压电喷雾离子源（ESI⁺）；正离子模式，选择多反应离子监测（MRM），用于定量的离子反应为：瑞舒伐他汀选择性反应监测：m/z482.2→m/z 258.2，瑞舒伐他汀-d6 选择性反应监测：m/z 488.2→m/z 264.2。

2.2.3 数据统计分析 

使 用 Phoenix WinNonlinVersion 7.0 以非房室模型进行 PK 分析，药代动力学 参 数 包 括 ：Cmax、AUC0 -t、AUC0 -∞、Tmax。

使 用 SASVersion 9.2 对主要药 动 学 参 数 Cmax、AUC0-t、AUC0-∞经对数转换后进行方差分析及双单侧 t 检验，并计算 90%置信区间，考察仿制制剂与参比制剂的生物等效性，如果 Cmax、AUC0-t 和 AUC0-∞ 的几何平均比（仿制/参比） 的 90％置信区间在 80.00％~125.00％，则认为两制剂生物等效[16]。

相对生物利用度的计算公式为：

（AUC0-t）T 为仿制制剂的 AUC0-t，（AUC0-t）R 为参比制剂的 AUC0-t。

2.3 群体药代动力学模拟

利用GastroPlus^TM模拟软件构建虚拟群体 （n=28，20~50 岁，健康中国人，男性和女性均 50％）模拟单次口服每种瑞舒伐他汀钙片的体内药代动力学。

模型建立参数见表 1。

计算每个虚拟受试者的 Cmax、 Tmax、AUC0-∞ 和 AUC0-t。

报告中位数和直接采用 5%和95%的结果表示 90％的置信区间。

瑞舒伐他汀钙在不同 pH 缓冲液中的溶解度曲线见图 2。

随着 pH 增加，溶解度先上升后下降。

药物在 各 种 pH 条件下的溶解度均大于 0.041 7 mg·mL^-1（以瑞舒伐他汀 10 mg 计），满足漏槽条件，各介质均可作为瑞舒伐他汀钙片的溶出介质。

3.2 体外溶出测试

仿制制剂（T）和参比制剂（R）在 3 种溶出介质中的溶出曲线如图 3 所示。

数据表示为 x±s（n=12）。

3.2.1 盐酸（pH 1.0）溶液中的溶出曲线相似性评价

3 批参比制剂在 15 min 时的平均累积溶出量均大于 85%，3 批仿制制剂在 15 min 时的平均累积溶出量小于 85％（图 3-A），因此计算 f2 因子评价仿制制剂与参比制剂体外溶出相似性 。

除 仿 制 品 批 号170703 的 f2 因子为 49，其他 2 个仿制品批号的 f2因子均大于 50（见表 2），认为仿制制剂与参比制剂在该介质中的体外溶出曲线基本相似。

3.2.2 醋酸盐缓冲液（pH 4.5）中的溶出曲线相似性评价 

3 批参比制剂在 15 min 时的平均累积溶出量均小于 85％，仿制制剂均不低于 85％（图 3-B）。

经计算 f2 因子均小于 50（见表 3），说明仿制制剂与参比制剂的体外溶出曲线不相似。

3.2.3 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.6）中的溶出曲线相似性评价 

虽然参比制剂的溶出速率较仿制制剂稍慢，但 15 min 几乎完全溶出（>85％）（见图 3-C）。仿制制剂与参比制剂的体外溶出曲线相似。

3.3 体内药代动力学研究

3.4 群体药代动力学模拟

图 5 显示了参比制剂和仿制制剂在虚拟的 28名健康成年中国人中的群体药代动力学研究结果，点代表实测的平均血药浓度，线代表预测的平均血药浓度。

两制剂药代动力学参数的预测值和实测值见表 5。

主要药代动力学参数 Cmax 和 AUC 的预测误差 （％PE） 不大于 10％；Tmax 的％PE 稍高，但小于20%，且参比制剂说明书报告了单次口服 10 mg 瑞舒伐他汀钙片后 Tmax 的中位值为 2.5~5 h，模拟值分别为 3.24（R）和 3.25（T），仍可接受[17]。

综上，认为GastroPlus^TM建立的群体药代动力学模型较为合理的描述了单次口服瑞舒伐他汀钙片的药代动力学特征。虚拟 BE 结果显示 Cmax 的几何均值比（T/R）的 90％ CI 为 86.44%~112.44%，AUC0-t的几何均值比的 90% CI 为 91.36%~118.80%，AUC0-∞的几何均值比的 90% CI 为 91.35%~118.80%，均在80%~125%的范围内，两制剂具有生物等效性。

瑞舒伐他汀钙在 pH 1.0 盐酸溶液中不稳定，降解产生杂质 B、D 及少量未知杂质，在此介质中的溶出曲线，均以主峰和酸降解产物的峰面积和计算[18]。

经试验考察，杂质 B 的相对校正因子为 1.0，杂质 D 为 0.9，在 0.9~1.1 范围内，且仿制药和参比制剂降解程度差异不大（见表 6）。

因此，采用上述文献方法计算瑞舒伐他汀钙在 pH 1.0 盐酸溶液中的溶出曲线，更科学合理。

在 pH 4.5 醋酸盐缓冲液中，仿制制剂与参比制剂的溶出曲线不相似，原因可能是参比制剂中含有碱性辅料磷酸钙，对制剂溶出有所影响。

虚拟 BE 试验和临床 BE 试验结果均表明仿制制剂与参比制剂生物等效，且仿制制剂已通过一致性评价。

综上认为，仿制制剂在 pH 4.5 的醋酸盐缓冲液中的溶出速率与参比制剂不相似，对药物的体内 PK 影响不大，仅仅通过体外溶出曲线相似性评价不能准确反映瑞舒伐他汀钙片的体内过程。

参比制剂在 pH 1.0 的盐酸溶液中的溶出速率快于仿制制剂，而在 pH 4.5 和 pH 6.6 的介质中的溶出速率慢于仿制制剂，可能是由于仿制制剂的包衣层与辅料及生产工艺与参比制剂不一致导致的。

由于临床 BE 试验结果显示两制剂各 PK 参数不存在显著差异，说明制剂经胃肠道到达吸收部位时，药物已基本完全溶出，溶出速率的差异被均一化。

对比实测的和模拟的药代动力学曲线，软件在吸收相拟合良好；在消除相，模拟比实测的消除稍慢，可能是由于模型建立所用的清除率和分布容积等数据是基于白种人的静脉滴注数据计算得到，与中国人存在差异导致的。

尽管虚拟 BE 和实际临床试验的药动学参数存在一定差异，但结果均显示仿制品与参比品生物等效。

虚拟 BE 试验为仿制药一致性评价工作的临床前研究提供了一种新的思路，即体外-PK 建模-体内研究。

为制剂处方筛选和 BE临床试验设计提供指导，降低制剂生物不等效风险，缩短药物的研发周期。

GastroPlus^TM等计算机模拟技术可用于仿制药一致性评价研究中。

详见 药学与临床研究 2019 Dec;27(6)

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