背景介绍：
TGN1412是一款靶向T细胞的共刺激受体CD28的超级激动剂，在2006年该抗体第一次进入人体临床实验时，6个健康的受试者在注射该抗体的90分钟之内便产生了严重的危机生命安全的细胞因子风暴。开发该抗体的公司TeGenero Immuno Therapeutics也在一年后宣布破产。事后的分析确认用于临床实验抗体的成品是符合标准规范的，尤其是排除了可能引起细胞因子风暴成因的内毒素的污染。这说明了在临床前研发阶段TGN1412的免疫毒性实验结果对人体内的安全性预测的失败。这些临床前的实验包括体外人和其他物种的淋巴细胞，全血细胞的细胞因子释放的测定，亲缘相近的灵长类哺乳动物食蟹猴的体内测定。后续的分析显示对TGN1412起响应的的是人的效应记忆性T细胞，和人体不同，食蟹猴中该亚型的T细胞低表达或者不表达CD28受体，这很好的解释了食蟹猴的实验结果对临床试验的预测失败，即使在食蟹猴50mg/Kg,而人体的注射剂量0.1 mg/kg的情况下。那么在体外实验中采用同种属的人的淋巴细胞和人全血细胞为什么没有起到预测临床实验免疫毒性的作用了？这是此篇文章小编要着重叙述的，实验方法的细节对实验结果产生的差异性影响。
体外免疫安全性测定方法设计：
TGN1412抗体的体外方法的作用浓度从0.5到 1000 μg/ml，此浓度范围与人/食蟹猴体内抗体的作用浓度相对应。
TGN1412抗体在人/食蟹猴的PBMC中的作用方式NIBSC设置了如下图6种作用模式Protocol 1(P1)- Protocol 6(P6)。
P1和P2为液相作用模式，即TGN1412抗体在溶液环境和PBMC细胞进行作用。P2相较P1，加入了抗TGN1412 Fc端的抗体，可以使得TGN1412在液相中形成多价的聚体复合物。这两种方法也是常规通用的，也是最初用于TGN1412免疫安全性的测定方法。
P3-P6为固相–液相作用模式。TGN1412包被吸附固定在固体界面上和处于液相内的PBMC相互作用，此类方法类似于ELISA的作用模式，P3-P6 TGN1412固定的模式不一样，P3采用的TGN1412直接采用包被液包被在96孔聚苯乙烯材质的组织细胞培养板中（湿法包被），而P4采用的TGN1412包被96孔聚苯乙烯板中风干以得到更加稳定和饱和的固定效果（干法包被）。P5,P6考虑到直接包被在固相中可能导致TGN1412的位点屏蔽现象，为间接包被，P5为干法包被抗Fc抗体后再湿法包被TGN1412，P6则是模拟体内环境，先铺上一层内皮细胞后再加入TGN1412液体。P3-P6这四种模式是TGN1412免疫安全性临床前体外未进行过实验设计。
同时测定方法采用了PHA，致有丝分裂人CD3激动抗体UCHT-1(R&D Systems)，不致有丝分裂恒河猴CD3抗体(clone FN-18; Abcam)，抗人 CD28 Ab (clone CD28.2; BD Biosciences)等作为阳性对照。
测定了以下的指标：1.采用ELISA对PBMC中细胞因子的释放含量进行检测 2.采用PKH26细胞膜荧光染料对PBMC中淋巴细胞的激活和扩增进行流式测定。3. 采用流式测定T淋巴细胞的激活和brefeldin A (2μg/well =36μM）作用下胞内早期细胞因子信号的测定。
实验结果分析
PBMC和全血中细胞因子的释放
液相作用模式P1,P2实验方案在TGN1412的高低剂量浓度下和人PBMC作用均未检测到相对于阴性对照基线浓度以上的细胞因子 TNF-α, IL-2, IL-6, IL-8, and IFN-γ的释放，此结果和TGN1412临床前免疫安全性的测定结果是一致的。与此结果相反的是，P4实验方案在3次独立重复实验中均，当TGN1412干法包被在96孔板的含量达到10μg/well和1μg/well时，与人PBMC或者20%（v/v）的人全血作用时，检测到远高于背景的TNF-α, IL-6, and IL-8的释放。而P4实验方案在食蟹猴的20%（v/v）的猴全血中也未检测到高于背景的TNF-α, IL-6, and IL-8的释放。
同时，采用固–液P6实验方案（铺板内皮细胞后再加入TGN1424），与人PBMC共培养也检测到大量显著的细胞因子释放。
淋巴细胞的增殖测定
与细胞因子的测定结果类似，采用液相作用模式未检测到人淋巴细胞的扩增，而采用固–液作用模式的P4方案中，当干法固定1μg/well的TGN1412能够检测到显著的人淋巴细胞的增殖，其在3天的培养过程中，TGN1412刺激的增殖的人淋巴细胞高达35%，如下图所示：
在P5固–液的作用方案（干法包被抗Fc抗体+湿法包被TGN1412）中甚至检测到更高的人淋巴细胞增殖率，这说明即使是P4方案（干法包被TGN1412）对人淋巴细胞增殖的影响也被低估了。与此截然相反，在同样采用P4模式，只检测到极其微弱的猴淋巴细胞增殖。
淋巴细胞的激活和胞内早期细胞因子释放
采用P4模式干法固定TGN1412分别和人或猴的淋巴细胞作用，均能够检测到CD4+淋巴细胞的激活的生物标志物CD25(IL-2Rα)的上调，但是猴的淋巴细胞并未检测到后续的增殖现象,如下图：
当对淋巴细胞胞内早期形成的细胞因子IL-2进行检测时，P4方案和P5方案均检测到显著的胞内细胞因子IL-2，和淋巴细胞的增殖测定结果类似，P5方案检测到的阳性细胞因子IL-2的细胞要远高于P4方案，再次说明即使同样是阳性结果，不同的实验方案将会带来不同的结果。
实验结果讨论：
CD28特异性的单克隆抗体激动剂在临床实验中显示了严重危及生命的细胞因子风暴的副作用。为什么在进入人体实验前，TGN1412临床前的安全性测试和食蟹猴体内的测试均没有对该抗体潜在刺激的细胞因子释放和淋巴细胞的增殖进行成功的预测？这个问题此篇文章中不同的实验方案导致不同的实验结果中找到答案。P1, P2体外实验方案并不能很好模拟人体内TGN1412和与人免疫细胞的相互作用，这也是TGN1412临床前安全性体外测定的方案。体外和体内结果的回顾性比较显示，体外的P4，P5，P6实验方案（固–液作用模式，合适足够的TGN1412剂量）可能更加贴近体内TGN1412与人免疫细胞的作用模式。
展望：
除了细胞因子风暴的安全性测定外，免疫调节生物制品的体外测定还有很多，如免疫原性的测定，感染和引起恶性肿瘤的测定，涉及到实验技术和实验方案更是多种多样。在这些多样化的实验方案中如何去评判简单条件下体外的免疫调节生物制品安全性测定结果和复杂情况下人体内生物制品的作用模式的关联，这是很难说清楚的一件事情。就TGN1412体内体外和临床的实验结果而言，小编觉都能从中吸取的经验教训是：对免疫调节生物制品人体内安全性的预测来源于体内动物和体外模拟的实验结论，实验结论来源于实验数据，而实验数据来源实验方案的具体设计，如何设计一个体外的实验方案让其能够尽可能的能够模拟人体内真实的相互作用模式是预测成功的关键。这个关键需要我们从有限的临床结果和体外结果的关联中去吸取经验教训，就如TGN1412案例中一般，同时也需要我们对单一目的的实验方案进行多样化实验条件的设计，就如同回顾性体外测定中P1-P6的作用模式一般，安全性测定要做全的同时，也要做多，做到细致。不管怎么说无论是从时间还是经济成本来说，体外实验的成本是远远小于临床成本的，这是对从业者专业化程度的要求。
参考资料：
Suntharalingam G, Perry M R, Ward S, et al. Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412[J]. N Engl J Med, 2006, 355(10):1018-1028.
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