听老师将讲HPLC的计算

外资大型制药公司技术、研发、质量总监，验证管理资深专家，多家制药公司顾问，药学硕士。国家工艺核对未雨绸缪之际，成功解决了多家在产产品处方、工艺问题。处方工艺的二次开发，免费咨询，全程保密。邮箱：1193686015@qq.com。

HPLC中涉及到计算的，主要是流动相配制和含量计算。RP-HPLC一般用缓冲盐配合甲醇乙腈作为流动相，计算主要涉及到如何配制流动相的问题。同时还要考虑到流动相配制的数量问题。HPLC计算主要运用外标法。内标法在HPLC分析中，运用不多。所以略讲。

流动相在HPLC中起到运输样品的作用。而流动相准确地配制，在HPLC测试中有着重要的作用。准确地配制流动相能够保证测试中保留时间的重复性。所以，配制起来不能掉以轻心。

对于流动相配制，我把它概括为以下几个字。

计算，称量，溶解，调节，<混合>，过滤，脱气。为什么我把“混合”外加了个框呢？这就是涉及到你的设备是否是单元泵还是多元泵的问题了。如果只有一台单元泵，也无电磁阀切换功能的泵，需要混合这个步骤，而多元泵，或者低压梯度切换的，可以不需要所谓的混合。各走各的。

打个比方说，如果我的流动相是：甲醇：纯水=60：40（v/v），对于单元泵，那么只能甲醇和纯水混合，作为流动相，而多元泵或者多元梯度泵，则可以有两路，A路放甲醇， B路放纯水，A与B各比例控制为60%，和40%。

对于HPLC 配制流动相，要保证流动性配制准确，也要保证流动相配制足量，不多不少，这样保证在这批测试中，流动相不至于不够，也不致于太多而浪费，流动相一般需要在2-3天内用完。那么首先确定流动相要配制多少。举一个例子。

要分析30个样品，10个对照品，样品和对照品都分析2次。一个试样分析20分钟，流速为1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流动相呢？通过计算来解决。（注：自动进样，连夜分析，可以设置停止泵程序）

一般来说，试样设置20分钟，还需要考虑进样的时间。假设进样时间为三分钟，那么一个试样所需要的时间为23分钟。我们可以计算：


根据计算，需要配制2208ml流动相。对于流动相，我们不能配制得太抠，需要考虑到吸滤头占的空间，那么我们再多配制个100-300ml，这取决于你的瓶底胖瘦。能够保证不被吸空为宜。那么我们就配制2500ml吧。

对于流动相如何配制，我们给一个实例

比如我要测试中药一清胶囊，我们翻阅中国药典，得以下信息。
一清颗粒是由黄连，大黄，黄芩（qin）组成。一般用于清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所导致的身热烦躁，目赤口疮，咽喉牙龈肿痛，大便秘结，吐血，咯血咽喉炎，扁桃体炎，牙龈炎等上述症候者。

其中黄芩主要成分黄芩苷用HPLC方法测试。先摘入如下：
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)为流动相，检测波长为275nm。有效塔板数按黄芩苷峰计算不低于5000
我们看到，其流动相是：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)，那么也就是说有水相识0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，其pH=2.7（用磷酸调节），有机相是甲醇。


要注意，对于HPLC用的试剂，水，溶剂，都是需要好的。试剂一般在分析纯以上。最好用优级纯，溶剂一般用HPLC级别。水用超纯水。所有的溶剂，溶液，都需要用0.45微米（或更细）的微孔滤膜滤过。也要保证溶剂瓶清洗干净。干燥。

流动相脱气是很重要的，现在一般的仪器都有在线脱气。当然，在配制流动相前脱气，亦重要。一般脱气又抽真空脱气，超声波脱气，吹He脱气，加热回流脱气等。最常用的是前两个脱气方法。当然，抽真空脱气效率比较高，但是要注意有机相是否在抽真空后比例改变的问题。所以，对于混合两相的流动相，最好单独滤过，再混合。混合后一般会产生气体，用效率略低的超声波脱气即可。超声波脱气，只要看到无明显气泡即可使用。

对于HPLC，我们一般使用外标法计算。那么有同学问，那么为什么内标法很少在HPLC上使用呢?

那么我们看下气相色谱和HPLC不同的进样方式。GC手动进样还是依靠进样针的定量进样，因为进样量很少，以微升计，所以，稍稍不留神，就有可能多进或者少进样。而且，进样针上的刻度也很粗，所以，GC用手动进样，使用外标法确实很考验测试者的娴熟技巧和过人的眼力。而内标法在GC进样测试中，由于内标物的调节作用，可以使得由于进样误差降低到最小，其相关的文章，查阅qinqingcao在本论坛的文章。但是HPLC进样是六通阀进样，其有一根定量环，如果手动进样能够保证定量环是充满样品溶液的，那么进样误差就几乎不存在。况且内标法需要寻找合适的内标物质，同时配制内标物，比较麻烦，所以在HPLC中很少听说用内标法定量计算。更多的，是使用外标法计算。

所以，HPLC手动进样一般使用3倍量的定量环进样。也就是说，20微升的定量环，我要注入60微升以上的样品溶液。保证定量环中充满着样品溶液。而多余的样品溶液会被排除。这样保证每次进样都是定量环中的那些量。对于定量环，这个体积一般也不是正好是20.00微升，但是我们保证进样过量（多余的溶液会被排出），则能够保证进样都是按照定量环中的体积进入色谱系统，这样消除进样的误差。对于定量环，在做完样品后需要用无溶质的流动相清洗数遍。如果定量环真的很脏，无法清洗了，那么可以裁剪一段管径和定量环相同的干净的不锈钢管，裁剪长度和定量管相同，安装上去。当然资金充裕的话，也可以购买厂家的定量环。

当然现在自动进样器很普及，那么使用自动进样器就更加方便了。

对于外标法，实际上也就是用已知浓度的对照品（标准品）来对样品中的该物质。这实际上很象砝码和天平。标准品就如同砝码，在同样的色谱条件下，标准品的峰面积和浓度已知，而样品中的峰面积可以测试出来，这样通过比例式子比较出样品中该物质的浓度了。

在这里，我想和大家说明的是，一般是通过保留时间做定性的。比方说，我测试维生素C，维生素C标准品在一定的色谱条件下，其保留时间为2.4分钟；样品在同样的色谱条件下，2.4分钟有峰，一般认为是样品中也许有维生素C。当然，保留时间定性确实有其局限，但是没有其他手段，那么保留时间还是能够发挥定性的作用。

对于定量，外标法定量，如果做的准确的话，需要用多点（浓度）定量。然而在企业用单点法定量还是很多的。对于做线性，精密度，回收率，这些内容我们在方法学验证中讲授，这里我还是着重讲解单点法校正。

在讲单点法校正，我先问同学们一个问题，如何用简单的方法来测试校园中的树高度？



通过一根已知高度的标杆，在太阳下投射在地面的阴影的长度，计算出树的高度。同样道理，我们也是用已知的标准品的浓度和峰面积，用样品中同一物质的面积，计算出样品中的那个物质的浓度。根据稀释倍数计算出样品中，该物质的含量。

如果与标准曲线联系起来，这个就是单点法。也就是说，以0为圆心，标准品浓度和面积在二元坐标的一点的连线作为校准曲线。得y=ax 其中的a就是斜率，也就是面积随着浓度的变化而变化，其变化率为a。


那么样品浓度的计算，就是按照其峰面积在坐标上的点，对应的浓度。用以下公式计算。

单点法：

我们给出一个例题。

测试果汁中维生素C含量。配制20mg/100ml的维生素C作为标准品。称取20.005g果汁到50ml容量瓶中，加入流动相溶解定容摇匀。滤纸过滤。吸取滤液10ml到50ml容量瓶中。流动相定容摇匀。标准品和样品均吸取20μl进色谱，分别得到峰面积24336（标准品），20129（样品）。计算果汁中维生素C含量（mg/100g）

今天qingqingcao讲了HPLC中的计算，首先是流动相的计算，同时简单讲了流动相配制的要点。其次讲了含量的测试，着重讲了单点校正之外标法。补充了内标法不太用于HPLC的大致原因，给出了单点法校正的计算例题一枚。希望大家能够掌握这简单的计算，下次我们讲讲方法学验证的内容。其中要讲授外标法之多点校正，精密度，回收率等。

有机合成——切断法

作者：药明康德

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液相色谱方法开发的一般规则

高效液相色谱方法的开发是一个繁复的过程，但不管再繁复，也有其规律可寻。方法开发过程中，一个总的原则是：先找到目标化合物的峰，然后调整峰形，再是进一步完善。

1.  找到目标化合物的峰：

要找到目标化合物的峰，我们该如何开展工作，先举一个例子，下面是分析氟康唑氯化钠注射液的一个谱图：

谱图上的内容主要包括：色谱柱、波长、流动相、温度、流速和进样量这几项。这意味着如果这几个色谱条件都确定下来了就可以基本认为这个方法已经开发成功，所以开发方法时我们可以通过逐一的考查这几个色谱条件来进行。

考查色谱条件是需要通过在色谱仪上进样来进行的，这就需要我们首先确立一个初始条件，即回答从何开始的问题。在回答好“从何开始”这个问题之前，我们先要了解我们的被分析物，就像一场战争，首先要知道自己的敌人是谁一样，我们要了解它的物理、化学性质，特别是化学结构式非常关键。所以，色谱方法开发工作可以通过如下的步骤来展开：

中药和民族药液相色谱标准图谱集

作者：李效宽　主编

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1）收集资料：

对它的分子量、结构式，以及在水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、正己烷和异丙醇中的溶解度有一个初步的了解。对分子量的了解在选择色谱柱的过程中是非常重要的，因为色谱柱填料的孔径对化合物的分离具有重要的影响，例子如图：

由此可以看出填料孔径对分离度和峰形是有一定影响的，120A的色谱柱通常适用的范围为分子量<10000的，如果分子量太大，在填料为120A孔径的柱子上分离度会比较差，因为样品分子在色谱柱上有较好的保留是由于可以进入到填料的微孔里面，与键合在表面上的C18长链相互作用，通常孔径直径需要大于分子直径的3倍以上才不会对分析造成影响。因此一般分子量10000一下的化合物建议用120A的柱子来分析，分子量大于1W小于20W的用300A的来分析，分子量大于20W的就要用凝胶柱了。

        结构式对于分子极性大小的预测以及后续调整峰形时具有非常重要的作用，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是极性基团，而苯环、己环、－CH＝、－CH2－CH3等都是非极性基团，根据经验大致对其极性做一下判断，估计一下可能在C18上（用得最多，我们最熟悉）的保留性能如何，再结合目标化合物在上述所说的几种溶剂中的溶解度状况，对方法开发时可能用正相柱还是反相柱来作一个粗略的判断，以及方法开发完成后的认证有作用。

色谱仪器

作者：何世伟　著

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2）选择色谱柱

    I）填料孔径的选择：根据所查资料获得的化合物分子量信息来确认色谱柱填料的孔径；

    II）填料键合相（键合相是指C18、C8、苯基柱等）的选择：在没能查到做过该样品的相关资料之前，或者并不了解其极性之前，通常最好选择C18柱作为初始的色谱条件。因为C18柱是我们用得最多的，也是对其色谱保留性能最了解和熟悉的，在C18柱上获得的信息我们可以预测其极性，以及为解决遇到的问题问题下一步可能将采取的措施。

    III）填料粒径、色谱柱型号的选择：在没有特别指明之前，最好使用我们常用的5um、4.6×150mm或250mm，和前面首选C18作初始条件一样，是为了方便预测其保留性能。

高效液相色谱仪器及其应用

作者：李昌厚

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分析化学手册. 6. 液相色谱分析(第三版)

作者：张玉奎 主编 张维冰，邹汉法，张丽华 副主编

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3）检测器和波长的选择

    目前使用最为普遍的是UV检测器，因此，在不了解其是否有紫外吸收的情况下，我们先要了解其这一性能，用标准品配成合适的溶液进行紫外扫描，收集目标化合物最大吸收波长的数据，确定波长；

或者是在有DAD检测器的条件下进几针标准品溶液，通过DAD的三维谱图可以获得化合物最大吸收波长的相关信息。

如无紫外吸收，则需选用合适的检测器。因为检测器是我们监测化合物是否出峰的工具，是我们的能看到化合物的“眼睛”，也是我们开发方法的基础，因此非常重要，需认真选择。

世界常用农药色谱-质谱图集：液相色谱-串联质谱图集(第一卷)

作者：庞国芳　等著

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4）流动相的选择

流动相的选择需要根据检测方式来确定，这里以UV检测器为例。液相的流动相最常用的体系有两种，一种是甲醇和水的体系，一种是乙腈和水的体系。

这两种流动相体系没有太大的差异，但还是区别的：

主要区别在于：

1）甲醇价格比乙腈便宜很多；

2）乙腈的洗脱能力比甲醇强；

3）甲醇在紫外上的吸收截止波长在210nm左右，也就是说在210nm以下基线的本底会比较高，与乙腈相比会大大降低化合物的峰高，削弱目标化合物的检测灵敏度；

乙腈的吸收截止波长在190nm左右；如果确定的波长在210nm以下，则应该选择乙腈和水作为流动相体系，如果远离这个波长的地方，则甲醇应该是首选。

5）流速的选择：与上述所确定的色谱柱型号相对应的流速，4.6mm内径色谱柱选1ml/min。

6）温度的选择：如化合物对温度没有特别的需求（如温度高了不稳定等），则在方法开发之初，尽量使用室温，这样开发出来的方法普适性会比较广一些。升高温度往往在后面为了提高目标化合物与其它杂质的分离度时使用的，或者为了降低柱压等，在进一步优化色谱条件时才去考虑。

综合以上所选择的一些条件作为初始条件，就可以开始下一步的目标——“找到目标化合物峰”。要找到目标化合物的峰，首先就要在我们最熟悉的C18柱上面测试一下，了解化合物的保留能力和大致的极性。

具体的步骤是：先用纯甲醇做流动相，看化合物是否被洗脱下来，如果被洗脱下来峰高是多少，收集这些数据；

然后流动相中甲醇的比例以10％的速度递减，即甲醇：水＝90：10、80：20、70：30。。。。纯水，看流动相从最初的100％甲醇——100％水的过程中每变动10％的比例，谱图上会多些什么峰，峰高会不会发生变化，多出来的峰是从哪里来的；

高效液相色谱仪器及其应用

作者：李昌厚

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1. 这个过程会有三种结果：

1）纯甲醇条件下没能洗脱下来，这样说明化合物的极性很弱，保留能力非常强，应该可以考虑用正相体系来做，如选择硅胶柱；

2）纯水条件下很难出峰而纯甲醇时很快洗脱下来，这意味着我们可以通过调整流动相的比例找到这个峰，并结合前面流动相比例10％变化的系列数据，选择合适的流动相。

3）纯水条件下也仍然很快就出峰，这说明化合物的极性很强，此时需要结合分子的结构式来判断，有可能是哪些基团导致了样品这么快的出峰，然后采取相应的对策，考虑添加缓冲盐，调节pH，如果需要的话，甚至考虑添加离子对试剂。

通常带有－NH2、－NHR、－NR2等基团的时候添加含－SO3－磺酸基的离子对试剂（如辛烷磺酸钠）以增强保留，而带有－SO3－、－PO4－等极性基团的化合物，则需添加如四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等含N＋R4的离子对试剂。

液相色谱分离材料——制备与应用

作者：欧俊杰，邹汉法 等编著

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2. 调整峰形

（请参看《峰形前拖解决方案》和《峰形后拖解决方案》）
《峰形前拖解决方案》http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20091030/2184029/
《峰形后拖解决方案》http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20091127/2234793/

3. 进一步完善方法

    进一步完善方法，主要是解决样品中的问题，如保留时间、目标化合物与杂质的分离度等。

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