生物大分子药物代谢消除途径及体外代谢研究方法进展

生物大分子药物代谢消除途径及体外代谢研究方法进展

作者

许娜，田浤，姚文兵

中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室

摘要

由于理化及生物学性质的差异，生物大分子药物与传统小分子药物相比，药代动力学机制更加复杂，在体内表现出不同的吸收、分布、代谢、排泄过程。

大分子药物一般不经CYP 450 酶代谢，其体内消除途径主要有肾小球滤过、酶水解、受体介导的胞吞消除和抗药物抗体介导的消除。

近年来，除了常用的免疫分析法、放射性同位素示踪法、LC-MS/MS 等分析方法外， 还有计算机模型被开发用于模拟预测大分子药物药代动力学性质的研究并发挥越加重要的作用。

本文主要综述了大分子药物主要代谢消除途径及体外研究模型TMDD、PBPK 的应用和发展。

随着生物技术的迅猛发展，生物大分子药物已被广泛用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和代谢性疾病等多种疾病。

与传统小分子药相比，生物大分子药物具有分子量和流体半径大，亲水性好，稳定性差等理化性质，且与人体内源性蛋白组成结构类似的特点，决定了其特有的复杂的药物代谢动力学特征（见表1），这增加了该类药物的检测难度。

由于缺乏高灵敏度和特异性的适用于大分子药物的检测方法，给研究者在临床前对其药动学带来了诸多困难。而在药物研发早期阶段就评估候选分子代谢性质有助于提高研发成功率，减少药物开发成本。

基于此，综合大分子药物的体内主要代谢途径、建立体外预测其药物代谢动力学（PK）特性的预测模型，并将其应用于大分子药物早期研究阶段显得尤为重要。

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生物大分子药物主要代谢消除途径

蛋白质、多肽类药物由氨基酸组成，与传统化学小分子药物相比，具有分子量大、结构复杂、稳定性差等特点，给临床前药动学研究带来了诸多困难。

生物大分子药物代谢消除途径主要有肾小球滤过、酶水解、受体介导的胞吞消除和抗药物抗体介导的消除。

1.1 肾小球滤过

药物分子的大小， 形状和电荷均会影响肾小球滤过，分子量较大的药物通常不会被肾小球滤过，而对于分子量小于肾小球滤过阈值（60 kDa）的治疗性蛋白，该消除途径的作用不容忽视。

重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）已被广泛用于骨髓移植和肿瘤治疗， 然而天然和重组G-CSF 易被肾小球滤过且存在酶降解，因而血浆半衰期较短。

研究者对GCSF融合人血清白蛋白第三结构域，一方面通过增大其流体半径而降低肾小球滤过，另一方面可通过与FcRn 结合而避免酶降解，使得该融合蛋白的循环半衰期约延长为原型的2倍，提供了具有潜在应用价值的创新药物分子。

相较于带负电荷的分子， 中性或带正电荷的分子更容易通过肾小球屏障，例如带负电荷的白蛋白比同等大小乃至分子更大的含中性葡聚糖的蛋白更不易通过肾小球屏障。

1.2 酶水解代谢

人体中存在多种蛋白水解酶， 所以酶水解作用在蛋白类药物代谢中也非常重要。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是葡萄糖依赖的肠降血糖素，具有良好的降血糖活性，但其在血清中易被二肽基肽酶IV（DPPIV）降解失活，致使其半衰期不足2 min，严重阻碍了其临床应用。

GLP-1 天然类似物艾塞那肽（Exendin-4）不易被DPPIV 降解，稳定性有所改善，半衰期为2.5 h，成为首个获批的GLP-1 类似物。此外，新型GLP-1类似物索玛鲁泰通过对氨基酸序列优化，增加了其对DPPIV的稳定性，半衰期延长至168 h，大大增加了患者依从性。

转移抑素是由54 个氨基酸组成的多肽， 其截断型转移抑素（45~54）体外活性是原型转移抑素的3~10 倍，但这两种多肽都对代谢酶敏感，可在小鼠血浆中被迅速代谢。

ASAMI 等通过对转移抑素改构，大大提高了其代谢稳定性，改构后的分子对胰凝乳蛋白酶、脑啡肽酶和基质金属蛋白酶9 等血浆蛋白酶具有抗性。应用动力学模型分析改构后的类似物在人血清中的半衰期，结果表明半衰期大大延长。

在生物药物研发早期，考虑酶水解造成的肽和蛋白质降解对分子代谢性质的影响， 并通过给予酶抑制剂或对水解酶易感部位进行改构，可以延长其半衰期。

1.3 受体介导的胞吞消除

参与细胞内吞作用的受体包括大分子药物的靶受体以及除靶受体以外的消除型受体，后者包含糖蛋白受体、Fc 受体和FcRn 受体。

蛋白质药物靶点明确， 特异性高，其发挥药效会选择性的作用于其专一性靶点，即靶受体。

靶受体与蛋白质药物结合后，通常会携带已经结合的蛋白质药物内化进入细胞， 并介导蛋白质药物的胞内降解过程。因此，靶受体的作用不仅与其药效学紧密相关，同时也会显著影响蛋白质药物消除过程。

靶受体介导的消除作用的大小取决于蛋白质对其靶受体的亲和力、靶受体表达水平、靶受体的内化率以及治疗性蛋白质的给药浓度和靶细胞内的分解代谢速率。

通常情况下，当治疗药物浓度低，靶受体浓度和内化率高时， 且蛋白质治疗剂与靶受体间的亲和力非常高时，靶受体介导的消除作用更显著。另外，靶受体介导的消除不仅发生于表达在细胞膜表面的靶受体，也发生在可溶性受体。并且与组织细胞上表达的靶受体相比，在血液中表达的靶受体一般对蛋白质药物消除的影响更显着。

可溶性靶受体与两个或多个抗体结合可导致吞噬作用并介导mAb 的快速消除。利妥昔单抗是一种抗CD20 单克隆抗体，被批准用于慢性淋巴细胞白血病患者的一线治疗，其药代动力学表现出时间依赖性，这可能与靶受体数目随着时间变化有关。

利妥昔单抗在循环B 细胞上的CD20 数目较多的患者体内表现出靶受体介导的消除速率更快。此外，关于利妥昔单抗多剂量研究报道，随着输注次数的增加，其消除率随之降低，这可能是由于利妥昔单抗治疗后靶细胞数量减少，导致靶受体介导的消除作用下降所致。

由于靶受体数量有限，该消除途径通常是可饱和的，因此， 该途径也是大分子药物非线性PK 特性的重要原因之一，且生物药物发挥药效也会使得靶受体数目改变，进一步改变靶受体介导的药物消除速率。

因此，在设计下一代生物大分子药物时，需在研发的早期对靶受体介导的消除作用进行研究，以避免临床上因该消除途径导致的分子吸收和生物利用度差、而造成不必要的失败。

FcγRs 通常表达于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等各种免疫细胞表面，可识别生物分子Fc 区域，并介导其内化及随后的细胞内分解代谢。

Fc 受体不仅可介导内源性IgG 的消除，也可以介导外源性治疗性蛋白的消除， 因此该途径为非特异性消除途径。

Fc 受体参与Fc融合蛋白、抗体类药物和可溶性药物-靶复合物的胞吞消除过程。目前，对FcγRs 介导的消除的意义和确切机制尚未研究透彻。

Kasturirangan S 等设计的靶向可溶性IL-6 上不同表位的双特异性抗体，以阻断IL-6 介导的信号。

该抗体由于可以结合抗原不同表位，形成更复杂免疫复合物，相较于含有单个抗原抗体的免疫复合物， 这些复合物能更快速结合FcγRs 并诱导吞噬和降解， 促使抗原被迅速中和消除的同时，不可避免也会影响抗体的PK。但是，有研究表明，FcγR介导的消除对于mAb 可能仅起很小的作用。

综上，FcγRs介导的消除作用对于靶向可溶性抗原和细胞表面抗原的影响有所区别。

糖蛋白受体介导的生物大分子消除主要有两条途径：去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein Receptor，ASGPR） 介导的消除和甘露糖受体（Mannose Receptor，MR） 介导的消除。

ASGPR 主要表达在肝窦状间隙的肝实质细胞表面， 可识别糖链末端的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基而介导糖蛋白被肝细胞内吞降解，在糖蛋白代谢中发挥重要作用。

本课题组前期研究表明，相较于唾液酸含量高的对照糖蛋白药物，低唾液酸含量的凝血因子VII 和帕妥珠单克隆抗体均由于ASGPR 亲和力更高， 而被肝细胞内吞消除更明显，体内半衰期也相应较短。

甘露糖受体主要表达在巨噬细胞和树突状细胞的细胞膜表面，可识别糖链末端的甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺残基而介导糖蛋白消除。末端为Man5 聚糖的IgG 消除率明显快于具有更复杂糖基化的蛋白药物。

Liu L 等的研究表明，毕赤酵母表达的融合蛋白倾向产生高甘露糖型， 且该糖型的Fc 融合蛋白会被高表达甘露糖受体的肝脏窦内皮细胞结合而快速消除。

尽管目前已研究了很多糖基化对于糖蛋白代谢的影响，但并没有形成完全一致的结论。研究者可以参考现有的研究成果，在新药研发中，对糖基化加以重视，并建立相应的研究方法评估糖受体对目的分子代谢影响，于研发早期规避代谢性质差的分子。

FcRn 受体主要表达在血管内皮细胞上，在特定蛋白药物消除中发挥保护作用。细胞通过胞饮作用摄取治疗性蛋白质（如IgG、Fc融合蛋白和人血清白蛋白融合蛋白），形成包含FcRn 的内体小泡。

FcRn 与蛋白结合呈pH 依赖性，内化的蛋白在酸性内体中与FcRn 结合并循环至细胞表面，通过胞吐作用重新释放至细胞外，在生理pH 下蛋白与FcRn 解离，继续发挥作用。

IgG 与FcRn 之间结合亲和力会影响IgG 的半衰期，例如IgG1，IgG2 和IgG4 的消除半衰期为18~21 天， 显著长于相似分子量的其他蛋白质。

研究者应用该代谢逃逸机制对几种抗体的FcRn 结合位点进行特异性突变以增加其代谢稳定性，延长循环半衰期。对蛋白融合Fc 或白蛋白结构域是延长目标分子半衰期的有效优化策略之一。

分子量为19kDa 的FGF21 具有增加脂肪细胞对葡萄糖摄取， 改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量等活性，而成为治疗代谢性疾病的优良靶点， 但是体内半衰期约0.5~2 h， 大大限制了其临床应用。

Yan 等通过原型FGF21 进行糖基化改造和Fc 融合而改善其酶稳定性和FcRn 依赖的代谢逃逸，获得长效FGF21类似物Fc-FGF21[R19V][N171]，该类似物在食蟹猴体内半衰期长达约200 h，大大增加了FGF21 用于临床代谢性疾病的慢性治疗的潜力。

Jenny 等研究了FcRn 介导重组凝血因子IX 白蛋白融合蛋白（rIX-FP）再循环，结果显示，rIX-FP 可以在酸性条件下被FcRn 介导内化， 通过早期内体-循环内体途径避免其被溶酶体降解，大大延长其半衰期（4~5 倍），并且该团队还建立了基于细胞评估治疗性蛋白循环能力的方法。

综上所述，FcRn 对mAb 等生物药物PK 性质影响巨大，在药物分子设计时可合理应用FcRn 介导的消除逃逸，改善分子PK 性质。

1.4 抗药物抗体介导的消除

向患者施用治疗性蛋白可引发免疫应答，导致抗药物抗体（Anti Drug Antibody，ADA）形成，进而改变蛋白质治疗剂的消除率。所有蛋白质治疗剂都具有潜在的免疫原性，其免疫原性潜力与蛋白质分子中非人源序列的部分、给药途径以及治疗的剂量和持续时间等因素有关。

一般而言，对免疫应答的影响与抗体的人源化程度成反比，但全人源抗体及其衍生物依然可能存在较高的免疫原性。相较于肌注和静脉注射，蛋白药物皮下注射更容易引起免疫原性。

mAb 的剂量可能与免疫原性成反比关系，有研究表明，低剂量的mAb 经常引起更大的免疫应答，并且产生免疫原性的概率一般随治疗时间的延长而增加。

ADA 介导药物消除途径的强弱取决于大分子药物上可被ADA 识别的位点数目。ADA 和药物结合后形成中和抗体和免疫复合物，进而触发网状内皮系统（RES）中的蛋白水解消除，造成药物的消除率增加。

英夫利昔单抗特异性靶向人肿瘤坏死因子α（TNF-α），在对其研究中发现，当患者体内形成ADA 后，会加速英夫利昔单抗的消除。

相反，若ADA 与药物形成的免疫复合物不触发RES 消除系统，则可以作为载体蛋白，延长蛋白质治疗剂如细胞因子和各种激素类药物的循环半衰期。然而，大多数情况下，免疫原性抗体导致治疗性蛋白质的增强消除。

因此，为了尽可能避免免疫原性引起的药物增强消除的风险，研制下一代蛋白治疗剂时，应采用各种计算机，体外和临床前工具在早期研发阶段对候选药物进行免疫原性预测。

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生物大分子药物代谢体外预测模型研究进展

目前常用的生物大分子药物代谢预测模型有靶介导的药物处置（Target Mediated Drug Disposition，TMDD）模型和生理药代动力学（Physiologically Based Pharmacokinetic，PBPK）模型。

2.1 TMDD 模型

TMDD 描述药物与其药理靶点（如受体、酶或转运蛋白）的高亲和力结合而影响其PK 特征的的现象。TMDD 最显著的特征为生物制剂的可饱和消除机制，特别是肽、蛋白质和单克隆抗体。当药物浓度低于某一阈值时，极有可能表现出非线性PK 特征， 这与靶容量对药物的消除影响密切相关。

TMDD 模型最早由Yan X 等于2001 年建立， 而具有TMDD 特征的药物主要是生物制剂，包括单克隆抗体、细胞因子和生长因子。

TMDD 模型如图1 所示，简而言之，中央隔室中的游离药物（C）以二级速率常数（Kon）与其靶受体（R）结合，形成药物-靶受体复合物（RC）。

RC 可以以一级速率（K_off）解离或以一级速率（K_int）内化并降解。游离药物也可以通过一级消除过程（K_el）从中央室消除。未结合的靶受体则可以以零级速率（K_syn）合成并以一级速率（K_deg）降解。

由于完整TMDD 模型参数较多，使用复杂，因而除了完整TMDD 模型外， 研究者们还建立了各种实用性更强的简化的TMDD 模型。

例如准平衡模型（QE）、准稳态模型（QSS）、快速结合模型（RB）、Wagner 模型和米氏模型（MM）。

QE 模型假定药物-靶受体复合物的结合和解离之间已达到平衡，该简化模型可用于预测药物的终末半衰期以及高剂量时药物的消除速率。

QSS 模型假设药物靶受体结合足够快以至于忽略药物解离/分布/消除和药物-靶受体/靶受体消除过程。

当药物-靶受体复合物的内化速率常数（K_int）远大于药物与靶受体的解离速率常数（K_off）时，该模型比QE 模型的预测结果更准确。

QSS 模型可准确预测受体数量接近零时的阶段，而对于药物而言大部分实验处于该阶段，因为从理论上讲，药物的目的是与受体结合， 并尽可能长时间保持其结合。因此QSS 模型可适用于多数数据点并预测出较准确的结果。

RB 模型假定Kint参数可以忽略不计， 而Wagner 模型假定靶受体总浓度是一个常数。MM 模型源自酶动力学中的米氏方程，该模型将反应速率和浓度关联起来，其成立的前提是QE 或QSS 假设成立，所以MM 模型事实上是QE 和QSS模型的特例。

若游离药物浓度超过靶受体总浓度或药物-靶受体复合物在药物结合饱和时是恒定的，则MM 模型与QSS模型相似，但是当游离药物和总药物浓度差异很大时，该模型则不适用。

MM 模型假定靶受体被完全饱和，因此，当药物的初始浓度较大时（即高剂量给药时），该模型适用性较好。MM 模型也适用于预测受体数量接近零时的阶段。

2.2 PBPK模型

PBPK 模型是结合生理学、生化学和解剖学等模拟机体循环系统的血液流向，将多个组织或器官用血流流向网络加以连接， 并遵循质量平衡原理模拟药物在体内的代谢过程，其中每一个房室代表一个组织或者器官（见图2）。

该模型由Li L 等于1986 年首次建立，是研究生理条件和药物特异性参数对PK 影响的有力工具。近年来，PBPK 模型已被成功用于描述人体或动物血浆和各种器官中抗体的药代动力学。

Shah DK 等建立了一个包含16 个组织区室的完整PBPK模型， 用于表征单克隆抗体在各种临床前物种和人体内的PK 性质。

然而， 完整PBPK 模型非常复杂， 且组织抗体浓度和FcRn 浓度等数据有限， 被用于描述人体中药物处置时可能会出现错误。进而衍生出了迷你PBPK（mPBPK）模型，该模型考虑了在药物处置中的关键要素，而不需要大量的不能可靠地被测量、获得或估计的臆测参数。

mPBPK 模型最初由Cao Y 等建立，并将其应用于解释人类受试者中治疗性单克隆抗体的PK。但该模型并没有涵盖内皮细胞中的FcRn再循环机制。

随后，Li L 等建立了包括FcRn 循环机制的mPBPK 模型，以描述人类受试者中IgG 的代谢。然而，该模型仍然存在局限性，例如，缺乏非平衡的FcRn-抗体结合和从血管到间质旁细胞IgG 输送参数等。

由于IgG 留在内涵体中的时间不足以达到IgG 和FcRn 之间的平衡，因此，描述FcRn 和抗体在内体中的相互作用时， 非平衡结合比平衡结合更合理。

Hardiansyah D 等建立了一种双孔迷你生理药代动力学（mPBPK）模型，用于描述人体中治疗性IgG 单克隆抗体的处置。该模型克服了先前PBPK 模型的多种局限，并能够描述具有不同FcRn 结合的亲天然IgG 和治疗性单克隆抗体在人受试者中的动力学数据。

为保证体外药代动力学预测模型的准确性， 需综合考虑目标分子在体内可能涉及的各个代谢途径。例如仅基于物理化学方法测定FcRn 亲和力推测抗体的代谢参数并不与实验测得的体内代谢相符， 这可能归因于除了FcRn 外，非特异性胞饮作用和TMDD 对PK 也存在不容忽视的影响。

有研究者建立了细胞FcRn 介导转胞吞作用体外研究方法，Jaramillo CAC 等用25 种单克隆抗体对该方法的适用性进行了评估，并对体内外数据相关性进行了研究。并证明该转胞吞测定方法适用于在体内研究前对候选分子FcRn 介导的消除保护评估，并有助于体内消除预测。

笔者所在课题组前期建立了体外研究ASGPR 介导糖蛋白消除的研究方法，并用于评估ASGPR 介导不同糖型变体帕妥珠单抗和凝血因子的强弱。

Vainshtein I 等开发了一种基于活细胞共聚焦成像技术和图像分析算法来定量测定Kint 的方法， 该方法测得的kint 可作为药动学体外预测模型的重要参数用于预测候选分子PK 特征。正如小分子药物研发，生物大分子药物的PK 特性的体外筛选有利于缩短研发周期。

因此，针对特定代谢途径，建立适用的体外测定方法，并将所得参数应用于PK 体外预测模型的开发和优化，响应“早评价，早淘汰”的研发策略，对于优化生物大分子药物具有重要意义。

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展望

生物大分子药物分子量大、结构复杂，与小分子药物相比具有独特和复杂的PK 特征，如存在靶受体介导的消除和FcRn 转胞吞等。

目前生物大分子药物药代动力学的研究通常都是在候选分子活性筛选之后开展，并且主要基于动物体内实验，但由于不同物种间代谢有相当大的差异，为了更准确地预测药物在人类的代谢，并指导合理药物设计，在药物发现早期使用人源性体外系统是非常重要和有价值的。

综合大分子药物代谢消除主要途径，建立体外测定方法，预测体内相应代谢性能， 对于候选药物的优化与选择极其重要，并且有益于“改进”（Refinement），“减少”（Reduction）和“替代”（Replacement）动物研究（3R）。

与小分子药物相比，生物大分子药物体外PK 预测的研究作为一门早期新的领域，亟需开发综合多参数的全面准确预测模型，用于生物大分子药物设计及开发早期的代谢性质评估，以提高大分子药物研发成功率，降低研发成本。