作者 l Timbersaw

编辑 l 细胞房间

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一、背景

2018年诺贝尔生理学和医学奖颁给了Allison教授和本庶佑教授，以表彰他们在肿瘤免疫疗法（Cancer Immunotherapy）领域的开创性工作，也让全世界越来越多的人认识到，免疫疗法将为肿瘤治疗带来革命性的改变。


当前，肿瘤免疫疗法的舞台基本被抗体和细胞疗法占据。PD-1/PD-L1抗体和CAR-T疗法成了我们耳熟能详的话题，部分肿瘤病人的生活质量得以改善，生存期得到延长，甚至实现彻底治愈。然而，需要指出的是，仍有相当一部分病人对PD-1/PD-L1抗体疗法不应答或出现疾病复发，CAR-T疗法副作用风险高、针对实体瘤的效果不佳、需要离体改造病人自身细胞且过程复杂，抗体和细胞生产成本都十分高昂，这些都是摆在我们面前亟待解决的问题。


制药界已经在进行各种积极的尝试，成百上千种基于PD-1/PD-L1抗体的药物联用策略，如通用型（off-the-shelf）CAR-T，RNA药物，肿瘤多肽疫苗等各种新技术、新靶点、新治疗策略不断涌现。本文将重点关注肿瘤免疫疗法的新热点—RNA药物，介绍RNA药物类型和竞争优势，临床结果和相关企业，产业瓶颈以及发展策略。

 

二、RNA药物与肿瘤免疫


2.1 RNA药物总览

提起RNA（Ribonucleic Acid，核糖核酸），我们再熟悉不过的就是中心法则的重要一环—mRNA（信使RNA）。但其实除了可以作为蛋白翻译模板的mRNA之外，还有多种类型RNA在生物学过程中起到重要作用，如图1所示：

  • 结构型RNA，如rRNA、tRNA、snRNA（小型核RNA）

  • 调节内源性mRNA表达的干扰RNA（RNAi），如siRNA、miRNA、piRNA

  • 起到鹰架（scaffolding）功能的长链非编码RNA，即lncRNA

  • 构成某些病毒基因组的RNA，即viral RNA

  • 有催化活性的RNA，即Ribozymes

RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？

▲图1. 不同RNA亚型和相关功能[1]

基于RNA开发的治疗性药物在靶点可及性、免疫原性、组织透过性、药物代谢、生产质控和成本等方面都有一定优势。制药界20多年来一直在不断尝试RNA药物的开发和工艺优化，已有近200个项目进入临床试验阶段，用于治疗癌症、传染病、激素性疾病甚至亨廷顿病等神经性疾病。处于临床开发的RNA药物中，较为成熟的有反义RNA，RNAi，RNA疫苗，RNA Aptamer（适配体），Ribozymes等。当然我们也不能忘了近年来非常火热的CRISPR-gRNA（guide RNA）。


RNA药物审批大事记：

  • 2016年9月，FDA批准Sarepta Therapeutics公司的反义RNA（可与mRNA互补的RNA分子，可抑制mRNA的翻译过程）药物Eteplirsen，用于治疗外显子51跳跃型杜氏肌营养不良（DMA）；

  • 2018年8月，美国FDA批准Alnylam公司的RNAi疗法Patisiran，用于遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR），使之成为首个获批上市的RNAi疗法。

  • 2018年10月，美国FDA批准Ionis Pharmaceuticals和其下属公司Akcea Therapeutics联合开发的反义寡核苷酸药物Tegsedi（Inotersen）上市，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）患者的多发性神经病（Polyneuropathy）。

 

反义RNA，RNAi，以及CRISPR/gRNA多应用于致病因素较为单一的疾病，而肿瘤是高度异质的，且致病机理十分复杂。因此，针对肿瘤治疗，RNA药物的开发策略主要集中在两个方面：1）激活机体的固有免疫（Innate immunity）和获得性免疫（Adaptive immunity）从而杀伤肿瘤，即RNA疫苗；2）结合并调节免疫抑制性或激动性受体从而促进效应细胞的杀伤作用，即RNA适配体。

 

2.2 RNA肿瘤疫苗（RNA Cancer Vaccine）

外源性RNA能够引发机体的固有免疫和获得性免疫反应。在肿瘤治疗中利用这一机理，以疫苗的形式引入外源性RNA，可以促进炎症细胞因子及干扰素的释放，激活NK、巨噬细胞、效应T细胞，将没有免疫细胞浸润的”冷肿瘤”变为“热肿瘤”，促进免疫系统对癌细胞的杀伤作用，也能协同提高免疫检查点抑制剂抗体的疗效，即在给免疫系统“松刹车”的同时“踩油门”，从而进一步增强抗肿瘤免疫反应。具体情况可分为两类：

 

RNA疫苗与固有免疫。固有免疫又称非特异性免疫，是机体识别病原体或“损伤事件”信号的重要防御机制。固有免疫细胞（如DC，NK，巨噬细胞等）上的模式识别受体（PRR）可以快速识别病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）（注：外源性RNA是一类重要的PAMP/DAMP），通过调节干扰素（IFN）及相关基因表达，促进炎性细胞因子表达等一系列细胞信号转导过程，实现对异源物质的抵御和清除，如图2。但需要指出的是，外源性RNA引发的固有免疫反应可能通过干扰素信号下调mRNA的翻译效率，影响mRNA疫苗对获得性免疫反应的激活（下文介绍），因此，关于是否需要对RNA进行化学修饰以降低其引发的固有免疫反应，仍待RNA疫苗领域进一步研究来权衡利弊。

RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？

▲图2. 固有免疫系统识别外源RNA[1]


聚肌胞苷酸（Poly I：C）一种合成的双链RNA（dsRNA），高效干扰素诱导剂，有广谱抗病毒作用，增强免疫和抗肿瘤作用。这类RNA药物主要通过激活固有免疫受体Toll样受体3（TLR3）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5），引发免疫反应，从以前的抗病毒/抗肿瘤疫苗的佐剂（adjuvant），逐步被开发为诱导抗肿瘤免疫反应的单一疗法。BO‑112是西班牙Bioncotech Therapeutics公司的核心资产，是一种由Poly I：C和聚乙烯亚胺（PEI）组成的复合dsRNA。BO‑112通过诱导自噬（Autophagy）引发癌细胞的细胞毒效应，目前正在I期临床试验检测与PD-1抗体联用疗效（ClinicalTrials.gov：NCT02828098）。

 

RNA疫苗与获得性免疫。获得性免疫又称特异性免疫，是机体受到特定抗原刺激后形成的，仅针对该抗原的免疫反应，主要有T细胞（细胞免疫）和B细胞（体液免疫）参与。B细胞介导的体液免疫主要与抗体产生相关，而T细胞介导的细胞免疫则有着更直接的抗肿瘤效应。抗原肽需要经由抗原呈递细胞（APC，最主要是DC细胞）处理，并通过主要组织相容性抗原复合体（MHC）呈递给T细胞受体（TCR），进而激发T细胞免疫效应。人工合成的肿瘤多肽疫苗已逐渐进入临床研究阶段，并在黑色素瘤等富集基因突变的肿瘤中初步显示出积极疗效。

 

但值得注意的是，有文献报道称，多肽疫苗主要通过APC的内吞体（Endosome）处理后经由II型MHC呈递并激活CD4阳性T细胞；而由RNA疫苗编码的抗原肽主要产生于细胞质内，经由I型MHC呈递并激活更具肿瘤杀伤作用的CD8阳性T细胞。因此，RNA可以作为开发肿瘤治疗性疫苗的新选择。

 

开发肿瘤治疗型RNA疫苗（由于需要编码抗原肽，基本均为mRNA疫苗），需要解决两个主要问题：1. 选择合适的目标抗原；2. 选择合适的递送策略（给药方式、载体、佐剂等）。

 

1 抗原的选择。前些年的肿瘤疫苗主要针对肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigens，TAA），但由于这些抗原也会在正常组织表达，最终可能因免疫耐受降低疫苗疗效，或是引发严重副反应导致自身免疫疾病。因此，近年来的肿瘤疫苗开发越来越聚焦于个性化的（Personalized）肿瘤特异性抗原（Tumor-specific antigen，TSA），也经常被称作肿瘤新生抗原（Neo-antigens）。那么如何找到某个病人的neo-antigens呢？简而言之，由于肿瘤的异质性，不同病人的肿瘤基因突变不尽相同，其中很多突变将编码产生仅在肿瘤部位表达的抗原，通过比对某一病人正常组织（一般用外周血PBMC或癌旁组织）与肿瘤组织的转录组，结合生物信息学分析便可筛选肿瘤特异性抗原，预测与MHC（人类HLA）结合最佳的序列，再通过体内体外模型试验从这些序列中找出能激发显著抗肿瘤免疫反应的一些抗原开发疫苗。mRNA和多肽疫苗的基本流程大致相同，如图3所示。但mRNA疫苗的递送方式更加多样化，下文介绍。

RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？

▲图3. 个体化肿瘤mRNA疫苗开发流程[1] 


2 递送策略的选择。在明确mRNA疫苗的靶抗原后，要解决是否对mRNA进行化学修饰，使用何种载体，以及选择何种给药方式这几个问题：


  • 化学修饰mRNA。有临床前研究显示，加入经化学修饰的碱基如假尿苷或1-甲基假尿苷等，可以抑制RNA固有免疫引起的翻译抑制，促进抗原肽表达及T细胞免疫的激活。但也有报道称未经化学修饰的RNA可以翻译出更多的抗原肽。这些差异可能来自试验系统的差别。另外，带正电的鱼精蛋白修饰的RNA可以避免被血清RNA酶水解，从而提高稳定性，但该策略的体内活性有待优化提高。正如上文‘RNA疫苗与固有免疫’段落所指出的，学术界和工业界还需进一步研究是否应对RNA进行化学修饰以增强RNA疫苗功效。


  • mRNA疫苗载体。学术研究中经常用到的阳离子多聚物或脂质体，如TransIT-mRNA(Mirus BioLLC)和Lipofectamine (Invitrogen)，作为RNA转染的载体效果明显，但上述载体的体内试验活性并不如体外试验那样显著，同时毒性可能较大。一些新型的阳离子多聚物或脂质体，如树状聚合物（dendrimer）和脂质体纳米颗粒（LNPs）成为了应用最广泛的mRNA疫苗载体类型。其中LNPs的广泛应用也得益于siRNA药物的快速发展。 

RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？

▲图4. mRNA疫苗的主要载体类型[2]

（a. 无修饰mRNA；b. 电穿孔递送无修饰mRNA；c. 鱼精蛋白修饰的mRNA；d. 阳离子纳米乳液载体；e. 树状聚合物纳米颗粒载体；f. 脂质体递送鱼精蛋白修饰的mRNA；g.阳离子聚合物载体；h. 阳离子聚合物脂质体载体；i. 多糖颗粒载体；j. 阳离子脂质体纳米颗粒载体；k. 融合胆固醇的阳离子脂质体纳米颗粒载体；l. PEG修饰的，融合胆固醇的阳离子脂质体纳米颗粒载体）


  • mRNA疫苗给药方式。mRNA疫苗给药方式主要有两种：1）直接注射，途径包括淋巴结内注射、肌肉注射、皮内注射、静脉注射、瘤内注射等。2）将mRNA疫苗转入离体的DC细胞，再回输给病人（ex vivo DC mRNA vaccine，类似于CAR-T的流程），途径亦包括淋巴结内注射、静脉注射、瘤内注射等。


直接注射。直接注射的优势是成本低，易操作，周期短。德国CureVac公司开发的抗肿瘤RNA疫苗结合了鱼精蛋白修饰，靶向多个肿瘤抗原，并以自身为佐剂，在临床前和临床试验中均取得了良好的疗效。美国Moderna公司也是mRNA肿瘤疫苗领域的主要参与者之一，成立8年来已融资超过20亿美金，估值75亿美金，Moderna的mRNA疫苗主要使用LNPs载体。另外值得一提的是淋巴结内注射的mRNA疫苗，可以提高mRNA被DC细胞摄取进而激活T细胞的效率。德国BioNTech公司开发了编码NY-ESO-1（一种TAA）的mRNA疫苗RBL001/RBL002，已完成淋巴结内注射治疗黑色素瘤的I期临床（NCT01684241），安全性良好。该公司基于其IVAC®-mutanome技术平台开发的个体化mRNA疫苗同样在I期临床中获得积极效果（NCT02035956），研究数据发表在2017年7月的一篇Nature文章[3]。但需要指出的是，淋巴结内注射需要超声辅助定位，且需多次经皮接种使得实际操作变得复杂，可行性降低。


mRNA转入离体DC细胞。mRNA转入离体DC细胞策略的优势是可以更高效地活化DC细胞，这个技术也可看作是经mRNA活化的DC细胞疫苗（已有一款DC细胞疫苗被FDA批准，即Provenge (Sipuleucel-T)，但市场化推广策略需改善）。Neo-antigen mRNA疫苗同样是该方向的热点，个体化的mRNA以电穿孔法或转染法转入分离的病人自体DC细胞。目前开发进展最快的是美国Argos Therapeutics的Rocapuldencel-T，在II期治疗肾癌的临床试验中与舒尼替尼联用取得了积极的疗效（NCT00678119），但笔者进一步查询发现，该公司的其他临床试验基本处于终止或撤销的状态，该公司的股价已在$1以下，目前可能有较严重的财务问题。总体而言，mRNA转入离体DC的策略成本较高，且耗时较长，技术难度较大，因此临床应用前景可能受限。

 

目前有多家大型制药企业通过自主开发或合作的方式进入mRNA肿瘤疫苗领域。上文提到的BioNTech与罗氏、拜耳、赛诺菲和辉瑞有研发合作项目；CureVac与BI、强生和赛诺菲有合作；Moderna与阿斯利康、默沙东有合作，等等。

工业界处于临床开发阶段的mRNA肿瘤疫苗汇总见表1RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？


2.3 RNA适配体（RNA Aptamer）

核酸适配体（Aptamer）是一类新型识别分子，其作用本质是一段单链核酸（DNA或RNA）分子折叠形成特定三维结构而与生物靶标高亲和力和高特异性结合，类似于抗体的作用模式。由于其分子量较小，可化学合成、稳定性好、毒副作用小，免疫原性小等优点，核酸适配体在许多方面体现了传统的免疫学与化学分子识别无可比拟的优势，在基础研究和应用领域有了快速的发展。

 

SELEX技术（指数富集的配基系统进化技术，Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）可用于筛选特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。RNA适配体还需注意调整骨架序列或核苷酸组成，以避免被RNA酶降解。

 

在肿瘤免疫领域，不同类型的RNA适配体有不同的作用机理，如图5所示，主要可分为四类：


  • 拮抗型适配体（Antagonisticaptamer）。用于治疗目的的适配体大多为拮抗型，目前处于临床阶段的适配体均为拮抗型适配体。在临床前研究中，拮抗型适配体能够有效抑制多种免疫负调控分子的功能，包括CTLA4，TIM3，IL10，LAG3等。


  • 激动型适配体（Agonistaptamer）。免疫激动性分子的激动型适配体尚处于临床前开发阶段，针对包括4-1BB，OX40，CD28，CD40等热门靶点。


  • 双特异性适配体（Bispecific aptamer）。已开发的有4-1BB/PSMA，VEGF/4-1BB，MRP1/CD28等。


  • 嵌合型适配体（Chimericaptamer）。

RNA药物-肿瘤免疫的下一个风口？

▲图5. 免疫调节型RNA适配体（图片来源：引用1）


适配体领域主要企业

最早获批上市的RNA适配体是一款治疗老年性黄斑变性（眼科疾病）的靶向VEGF的适配体Pegaptanib（培加他尼，商品名Macugen），由NeXstar Pharmaceuticals开发（已被Gilead收购），于2004年获得美国FDA批准。目前临床试验中还有多种针对眼科疾病的适配体，这里不做过多介绍。

 

德国NOXXON公司有两款适配体目前在临床阶段开发肿瘤免疫疗法，NOX-A12和NOX-E36，分别靶向基质细胞衍生因子1（SCDF）和CCL2这两种发挥免疫抑制功能的趋化因子。NOX-A12与PD-1单抗Keytruda联用治疗胰腺癌的I/II期临床正在进行中（NCT03168139）。

 

一、产业瓶颈&发展策略

技术的快速革新极大地促进了RNA药物的发展，但目前仍有一些产业瓶颈亟待解决。表2归纳了RNA药物相较于抗体和细胞疗法的一些优缺点。


以下三个方面对于优化RNA药物疗效和安全性至关重要：


稳定性。从进化的角度讲，RNA的稳定性是受到严格调节的，从而维持正常的蛋白表达和细胞功能。RNA的稳定性可以通过以下策略调节：a）序列中加入特殊的，不被RNA酶水解的核苷酸；b）调整或人工嵌入各种功能元件，如5’端帽子（5’ cap），3’ 非编码区（3’ UTR）和Poly-A尾巴等；c）序列密码子优化（codon optimization）等。

 

靶向递送。由于RNA带负电，因此RNA药物如何有效穿越细胞膜（磷脂双分子层带负电）也成为了一个问题。细胞主要采取内吞的方式摄取RNA，如DC通过巨胞饮作用（Macropinocytosis）。另外，如前所述，选取合适的载体以及给药途径也非常重要。脂质体纳米粒（LNPs）载体、皮内注射给药等都可以促进肿瘤疫苗的疗效。

 

副作用。为了能有效减少注射反应和炎症，要考虑优化RNA的序列/结构和递送载体。相应策略有：严格筛选高纯度的RNA，采用化学修饰的核苷酸，使用LNP载体，使用PEG修饰增加药物半衰期等。另外，也有研究人员通过算法预测，采用多重RNA混合物等手段减少脱靶效应（off-target effect），这一点在siRNA等RNA干扰领域应用较多。

 

联合疗法

前文提到，多项关于RNA疫苗与PD-1抗体联用的临床试验已在进行中。从作用机理上讲，这种联用策略是较为合理的，在PD-1单抗拮抗免疫检查点的同时，由疫苗激发的固有免疫和获得性免疫功能将从不同的方面促进免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，从而达到治疗肿瘤的目的。需要注意的是，这种联用可能引发较为强烈的免疫反应，导致副作用，需要谨慎探索合适的剂量和治疗顺序。

 

RNA药物与放化疗等手段联用的策略已在临床前模型中显示效果，需进一步在临床试验中确认。


参考文献

1. Pastor F, Berraondo P, Etxeberria I, et al. An RNA toolbox for cancer immunotherapy[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17(10): 751.

2. Pardi N, Hogan M J, Porter F W, et al. mRNA vaccines—a new era in vaccinology[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17(4): 261.

3. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer[J]. Nature, 2017, 547(7662): 222.

4. Burnett J C, Rossi J J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects[J]. Chemistry & biology, 2012, 19(1): 60-71.

5. Cross R. Can mRNA disrupt the drug industry?[J]. Chemical & Engineering News, 2018, 96(35): 34-40.

6.  RNA新药的春天来临了吗？

7. RNA药物：从”RNA世界“走向临床。http://blog.sina.com.cn/s/blog_8088f3700102wc7h.htm

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