华南药物代谢研究中心概况及应用案例分享

引言华南药物代谢研究中心是中国华南地区专业从事药物代谢研究、毒代动力学研究和临床生物样品检测的公共服务平台。中心拥有完善的组织架构、健全的项目管理及质量保证体系，建有约2000m2的功能实验室、生物样品库及实验动物房设施，以及经过3Q验证的检测仪器。中心实验室已通过国家GLP认证检查并获得药物GLP认证批件，实验室的运行及管理均符合GLP和GCP规范，遵循ICH、CFDA和FDA的指导原则。LC-MS/MS生物样品检测能力通过了2017年中国食品药品检定研究院举办的能力验证评定，可根据客户需求设计并开展非临床DMPK试验、临床生物样品检测统计分析。

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平台服务内容

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LC-MS/MS方法的开发及方法学确证

符合GLP规范的Water液质联用仪UNIFI软件管理；
高灵敏度的检测能力（检测限可达到1pg）；
经验丰富的技术团队，拥有近50个已完成确证的化合物分析方法（临床样品检测、毒代动力学、药代动力学、微粒体及细胞代谢等多种生物基质方法开发经验）；
快速的方法建立与确证，技术人员与研究人员的高效分工与合作。

体内药代动力学及PK/PD研究

拥有近2000m2符合GLP规范的啮齿类及非啮齿类动物饲养设施；
支持大鼠、小鼠、豚鼠、犬、兔等多种实验动物的体内ADME药代动力学研究，猴实验室正在扩建中；
支持各种基质（血浆、组织、尿液、粪便等）中的原型药及主要代谢产物的定量分析及代谢产物结构推测，进行生物转化研究；
提供仿制药Beagle犬体内生物等效性预实验服务，提高临床BE通过率；
通过各种动物模型开展PK/PD研究；

体外代谢研究

体外药物代谢研究

药物代谢稳定性研究

肝微粒体、S9代谢的种属差异性研究

CYP450代谢表型鉴定

药物转运

转运体对药物的摄取与外排作用

Caco-2细胞

MDCK细胞

血浆蛋白结合率研究
药物相互作用

CYP450酶诱导与酶抑制作用
BE生物等效豁免

正在构建在体肠灌流、细胞渗透性模型，用于BE等效豁免研究。

临床生物样品检测

提供遵循GCP和GLP的要求开展生物等效性试验（BE）生物样本分析服务。

研

究实例分享案例一

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LC/MS/MS检测能力

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1、仪器灵敏度：Water TQ-S液质联用仪的检测限可达到1pg，分析浓度为1 pg /μL的利血平样品，进样体积1μL，信噪比S/N大于10000。（2018年PQ数据）

2、线性：图1-1 Water TQ-S液质联用仪分析0.5~50pg/μL（进样体积1μL）的金刚烷胺的线性图（2018年PQ数据）：

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3、精密度与准确度：表1-1 Thermo TSQ-Endura液质联用仪分析金刚烷胺的批间精密度准确度结果（2018年PQ数据）：

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END

华南药物代谢研究中心概况及应用案例分享 研究实例分享案例二

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创新脑中风1类新药PK-PD研究——GB2注射液在MCAO大鼠模型的PK-PD研究

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1、试验方法：

模型建立与给药：采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤（MCAO）病理模型，动物分为模型对照组（静脉注射溶媒）和GB2组（静脉注射10mg/kg的GB2）。

检测指标：GB2组于给药后第2h、3h、4h、6h对大鼠进行神经功能评分（NFs），后分别按时间点处死大鼠取血液和脑组织，称取脑重量，计算脑指数；LC/MS/MS测定血浆及脑匀浆样品中GB2浓度；并测定脑组织中脑梗死面积、血浆中PAF含量。

数据统计：（1）NFs下降水平（%）=（NFs 给药组- NFs模型组）/ NFs模型组×100%；（2）AUC下降水平（%）=（AUC 给药组- AUC模型组）/ AUC模型组×100%，各效应指标AUC根据相应效应指标-浓度时间数据采用梯形法计算。通过SPSS13.0完成线性分析。

2、试验结果

结果分析：通过PK-PD分析GB2在大鼠体内的血药浓度-效应关系，结果见下图（对照组及GB2组每个时间点动物数n=8）：

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图2-1、2-2显示，大鼠的NFs变化率（%）与大鼠血浆GB2浓度间存在线性关系：y = -0.0097x – 24.855 (R2 = 0.6642)；大鼠的NFs变化率（%）与大鼠脑组织GB2浓度间存在线性关系：y = -0.4225x – 22.819 （R2 = 0.7236）。其中大鼠的NFs变化率与大鼠脑组织GB2浓度的相关性更好，提示在本研究中，大鼠神经功能随着GB2浓度的增加而改善。

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图2-3、2-4结果显示：大鼠的脑指数AUC下降水平（%）与大鼠血浆GB2浓度间存在线性关系：y = -0.0152x – 28.644（R2 = 0.9407）；大鼠的脑指数AUC下降水平（%）与大鼠脑组织GB2浓度间存在线性关系：y = -0.6264x – 25.896（R2 = 0.9135），提示在本研究中，大鼠脑水肿程度随着GB2浓度的增加而减轻。

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图2-5、2-6结果显示：大鼠的脑梗率AUC下降水平（%）与大鼠血浆GB2浓度间存在线性关系：y = -0.1122x – 22.898（R2 = 0.7261）；大鼠的脑梗率AUC下降水平（%）与大鼠脑组织GB2浓度间存在线性关系：y = -4.8239x – 0.1557（R2 = 0.7690）。其中大鼠的脑指数AUC下降水平（%）与大鼠脑组织GB2浓度的相关性更好，提示在本研究中，大鼠脑梗率随着GB2浓度的增加而减低。

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图2-7、2-8结果显示：大鼠的血浆PAF含量AUC下降水平（%）与大鼠血浆GB2浓度间存在线性关系：y = -0.0426x – 25.189（R2 = 0.9017）；大鼠的血浆PAF含量AUC下降水平（%）与大鼠脑组织GB2浓度间存在线性关系：y = -1.7995x – 16.935（R2 = 0.9228），提示在本研究中，大鼠血浆中PAF含量AUC下降水平随着GB2浓度的升高而下降。

3、总结：

本研究中，根据模型大鼠静脉注射GB2后的血药浓度时间数据，结合神经功能评分、脑指数、脑梗率、血浆PAF含量等效应指标，经PK-PD相关性分析：

随着浓度的增加，GB2可改善大鼠神经功能，减轻脑水肿程度，降低脑梗率，还可减少机体PAF的生成或促进其消除。
上述量效关系结果，大鼠GB2血浆暴露量与脑组织暴露量间均未见明显的差异，提示两者间具有较好的动态平衡一致性。

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犬BE在仿制药处方工艺一致性评价中的指导作用

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1、药物A理化性质：pKa = 3.75（盐酸基团）；

溶解性：在甲醇，乙醇、丙酮中溶解，微溶于水，几乎不溶于乙醚；

溶解度：pH1.2：43mg/mL，pH3.6：11.5mg/mL，水：13.4mg/mL ；

分配系数：1.25（1-辛醇/pH6.5的磷酸盐缓冲溶液）；

BCS分类：III类（高溶解-低高渗透）

2、药代动力学信息：

给药后1～2小时达到Cmax。T1/2约为10小时，1天给药1次。空腹生物利用度（F）大约为25%，与食物同服时生物利用度可增大约40%，本药70%～80%以原形经尿液排出体外。

3、犬BE试验设计：

Beagle犬按性别、体重随机分为受试制剂组、参比制剂组，进行双周期交叉给药试验，清洗期间隔为7天。口服给药剂量为1片（10mg）/条。分别于给药前（0h）及给药后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h于犬隐静脉丛采血约2mL，离心分离血浆，LC/MS/MS分析药物A的血浆药物浓度。

4、试验结果分析：

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图3-1 受试制剂和参比制剂血药浓度-时间曲线图

图3-1结果显示：首次进行犬BE预测，A、B、C的AUC明显低于参比R，判断受试制剂与参比制剂BE不等效。受试制剂溶出过慢，需要调整处方工艺，增加溶出。（A为片剂；B和C为胶囊剂）和参比制剂（R为片剂）

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图3-2 调整工艺后受试制剂和参比制剂血药浓度-时间曲线图

图3-2结果显示：，A、B、C受试制剂的AUC优于参比制剂R，判断受试制剂与参比制剂BE不等效。受试制剂溶出过快，需调整工艺，降低溶出。（A为片剂；B和C为胶囊剂）和参比制剂（R为片剂）

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图3-3 再次调整工艺后受试制剂A和参比制剂R血药浓度-时间曲线图

试验制剂A与参比制剂R的AUCt、AUCi及Cmax经对数转换后，以双向单侧t检验法、1-2α置信区间法进行等效性检验，结果均表明以AUCt、AUCi、Cmax为指标，置信区间包含且宽于等效区间；对两种制剂的Tmax进行非参数Wilcoxon检验，结果显示无统计学差异，表明以Tmax为指标两制剂生物等效。经计算试验制剂A的相对口服生物利用度为105.88%±12.13%，说明两制剂生物等效性。综上结果提示，需通过加大试验样本量来缩短以AUCt、AUCi、Cmax为指标进行检验的置信区间，以提高人体生物等效性预实验的通过率。

5、犬BE指导仿制药处方工艺及临床一致性一致性评价中研究思路：

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