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一、为什么异构体的校正因子不是1？
在做杂质检测分析方法（如有关物质）的方法验证时，某些结构式与主成分接近的已知杂质，根据线性斜率的比值计算却发现斜率偏离1较大，理论上可以不加校正因子计算检测结果的组分竟然需要加上校正因子。这并不是什么太大的问题，但是有时候手性异构体的校正因子不是1，那就是问题了。因为这不符合常理，如果方法验证时出现异构体的校正因子不是1，质量标准上异构体的检测结果需要加校正因子计算的话，极可能引起审评老师的质疑。
一般情况下，异构体的校正因子不是1，都是某些方面出了问题，下文将可能导致异构体校正因子不是1的原因进行分析。
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待测物为成盐化合物
以API为例，如果待测物为成盐化合物（如枸橼酸托瑞米芬），那么可以知道在做方法验证时，主成分对照品应该为成盐的形态。如果异构体对照品为自制对照品，合成的同事很可能提供的是没有成盐的形态。很多同仁不会注意到这个细节，需要注意的是，如果该杂质具有与主成分类似的结构，也可以成盐，那么即使获得的对照品是未成盐的形态，在进行计算时应当折成与主成分相同的形态，即如果主成分是以成盐形态的浓度，该杂质也应当是成盐形态的浓度。
以枸橼酸托瑞米芬为例，药典收载了其E-异构体的检测方法。在做该方法验证时，如果E-异构体的对照品为未成盐形态，则如果根据线性斜率比值计算的校正因子应该是0.68。如果以成盐形态计算，则校正因子应是0.68÷（1-192.14/598.10）≈1。这种情况下，该杂质在原料药与制剂中的校正因子一致。
当然，如果该杂质不具有与主成分相同的成盐基团，即使其他基团与主成分一致，也应以不成盐形态计算校正因子。这种情况下，如果制剂的规格以未成盐形态计算，则该杂质在原料药与制剂中的校正因子不一致；如果制剂的规格以成盐形态计算，则该杂质在原料药与制剂中的校正因子一致。
以上内容比较难以理解，且为个人之见，请读者仔细斟酌。
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杂质对照品纯度不足
如果杂质对照品纯度不够，可以想象即使校正因子的真实值为1，计算出的结果也会偏离1。杂质对照品大多难以获得，自行制备的量一般数量较少，难以按照质量平衡法进行标定，一般标定时大多为通过液相检测主成分纯度的方式。这就留下了实际纯度与检测纯度不一致的隐患，如水分、溶剂、无机盐等液相无法检出的杂质含量较高，即有可能导致实际纯度远低于检测纯度。于是计算的杂质的校正因子偏离真实值。
分析人员在获得自制对照品时，应当评估对照品纯度可能存在的风险，对杂质对照品的合成工艺进行评估，对可能导致纯度不足的风险进行严谨的分析。例如最后一步为盐析，需评估杂质对照品中无机盐含量过高的风险；其他如水分、溶剂含量过高的风险也需要进行类似的分析。
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主成分与杂质各级别的线性色谱峰不在同一个色谱图中
一般情况下，建议线性验证时，如果需要计算校正因子，应当配制各级别浓度的主成分与各杂质的混合溶液，使得不同级别的主成分与杂质峰在同一个色谱图中。这样排除了仪器响应值存在偏差的风险，如果主成分与杂质分别进行线性验证，则增加了因为仪器响应偏差导致校正因子偏离真实值的风险。
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主成分线性溶液浓度与杂质相差过大
一般情况下，如果需要计算校正因子，主成分与杂质各级别线性溶液的浓度应当接近。虽然根据朗伯比尔定理，响应值与浓度成线性关系，即斜率是固定的；但是我们都知道这是理想的状态，现实中各种复杂的环境会使得响应值偏离朗伯比尔定理。因此为了减少校正因子偏离真实值的风险，应当使得主成分与杂质各级别线性溶液的浓度接近。
如果主成分的线性验证范围远大于其他杂质，建议在与杂质相同的线性验证范围内与杂质浓度一致，并取该范围内的数据进行校正因子的计算。
二、线性为什么总是做不好？
A. 原因之一 误差
实验过程中的误差是线性验证的结果偏离理想状体的一个重要原因，误差越大，意味着某个变量的响应偏离预期值越大，在线性验证的结果中就体现出得到一个糟糕的相关系数与截距的值。
实验过程的误差主要来源于两个方面：操作过程的误差与仪器响应的误差。
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操作过程的误差
操作过程引入较大误差常见不适宜的做法有：从贮备液稀释不同浓度线性溶液时，取样体积过小；如体积为0.8ml、0.9 ml 、1 ml、1.1 ml与1.2ml等；小的取样体积必然引入较大的误差，即实际浓度偏离计算浓度较大，导致线性相关数据偏离较大。这一类操作误差一般为随机误差，它在线性数据一般表现为下图的形式：
为减少操作误差，由贮备液稀释线性溶液时，取样体积应尽可能大；如含量测定线性验证，建议取样体积应不小于10ml，量瓶体积应不小于100ml；杂质线性验证也应充分评估操作过程引入的误差对验证结果的影响。
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仪器响应的误差
仪器响应误差越大，线性越差，这个现象众所周知；GC的响应误差一般大于LC，所以GC的线性验证数据一般较LC为差。导致仪器响应误差的原因多种多样，仪器原理或性能等方面不能纠正的情况本章节不予讨论，仅论述方法或实验设计等方面的原因。常见的导致仪器响应较大误差的原因一般有波长选择不合理、流动相pH值选择不合理、色谱峰拖尾与进样体积过小等。
2.1 检测波长选择不合理
如方法检测波长不是组分实际上的最大吸收波长，则仪器响应误差较大。导致该情况的原因常见于采用紫外分光光度计获得组分光谱图，所选稀释剂不同于流动相；该情况下即组分在HPLC系统中的最大吸收波长与检测波长不一致。
2.2 流动相pH值选择不合理
许多时候组分电离状态与未电离状态的响应值有明显不同，如流动相pH值不在组分的pka±2范围外，且流动相缓冲能力不足，分析过程中组分电离状态变化较大，导致响应值差异较大；
2.3 色谱峰拖尾
色谱峰拖尾导致积分不准确，响应值的误差较大。
仪器响应的误差一般也都是随机误差，其线性表现形式同操作误差。
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溶液未分散均匀
某些组分在稀释剂中分散需要一段时间，如果振摇澄清后立即将溶液倒入进样小瓶，很可能由于溶液尚未分散均匀导致进样小瓶中的浓度与溶液平均浓度不一致。
B. 原因之二：流动相本底吸收大
如流动相本底吸收大，即检测波长低于或接近流动相的截止波长，流动相有较大的吸收，可能会对线性产生一定程度的影响。尤其在杂质的线性验证中，这种影响非常明显。最常见的表现形式是低浓度下的响应值与高浓度不成相应的比例，即浓度为一半的溶液响应值远小于高浓度响应值的一半。一般来说，如果流动相本底吸收大，截距一般为负值，且回收率验证中低浓度样品回收率较低，高浓度样品回收率较高；其线性表现形式一般如下图：
C 原因之三 溶液未分散均匀
某些组分在稀释剂中分散需要一段时间，如果振摇澄清后立即将溶液倒入进样小瓶，很可能由于溶液尚未分散均匀导致进样小瓶中的浓度与溶液平均浓度不一致。如果没有研究溶液分散均匀所需时间，可能某个浓度点的进样小瓶溶液浓度与计算浓度差异较大，导致线性数据异常，其表现形式一般为下图：
D. 交叉污染
此处论述的不是引入外源的污染，这是操作失误，不属于本文论述的范畴。这里的交叉污染指的是杂质对照品不纯含有另外一种需要研究的杂质，如杂质A中含有10%杂质B，如果配制混合线性溶液，杂质A中含有的杂质B必然影响杂质B的线性结果。这种情况下，杂质A与杂质B应当分别验证，不宜配制混合线性溶液。
三、定量限测不准原理
定量限验证异常情况1：连续进样，出现信噪比小于10的数据
如上文所述在早期（如十年前）的方法验证中，定量限验证仅要求确认信噪比为10的各组分浓度，后来逐渐增加了考察信噪比为10的各组分定量限浓度下的响应情况的精密度研究（定量限验证的做法在近些年也发生了许多的变化，如早期主要的工作在于确认信噪比10的各组分浓度，演变为定量限也需要考察响应情况的精密度，直至目前主流的定量限还需要考察回收率的结果）。由此必然会引入一个风险，即样品浓度一致信号响应大致相同，但是不能确保每次进样的噪音都完全一致，遂出现信噪比在10附件波动的情况，可能某一次或数次信噪比小于10，不符合相关指导原则对定量限的定义“一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限”。
由于上述情况的出现，引起了许多人对定量限概念的思考，该阶段的思考主要在以下几个问题：
1、信噪比能说明什么？–定量限测不准原理
信噪比，顾名思义，就是组分响应信号与基线噪音的比值。我们都知道，液相色谱的响应值并不是一个固定值，会随着仪器状态（如氘灯能量）、不同品牌型号等差异导致响应信号不同；基线噪音也是如此，不同流动相、不同日期、不同仪器、不同类型检测器、同一台仪器不同状态等都会导致噪音的值存在明显的差异。通过以上分析可知，信噪比是一个随机的不确定的值，那么这个值到底能说明什么问题？
上面的问题很难回答，但是有一点能确定，即方法验证过程中找出来的信噪比10的浓度的溶液，换一台仪器或者换流动相等参数，信噪比就极大可能不是10了，这是个几乎不能重现的结果。换个角度分析，也可以说信噪比10的溶液浓度是不确定的。由此我们可以得出一个原理，即定量限测不准原理，该原理可以表述为以下的形式：以信噪比10为某个组分的定量限，则其浓度是不确定的；以某个确定的浓度为定量限，则其信噪比不一定总是10；即信噪比10与浓度二者必有一个是不确定的。
2、定量限的信噪比必须是10吗？
由于定量限测不准原理，越来越多的人在质疑定量限信噪比10的规定的合理性，于是许多人逐渐摒弃了定量限信噪比10的规定，但是这些人中分出两个主要的群体：一部分人有限摒弃该规定，具体做法是配制某个浓度（一般为限度的1/n，n≥2），在这个浓度下信噪比大于10，但是也不能偏离太多，一般不大于100；另一部分人为彻底摒弃，具体做法是配制某个浓度（一般为限度的1/n，n≥2），在这个浓度下信噪比大于10即可，以确认方法有足够的灵敏度。
到目前为止，仍然有许多同仁陷在定量限信噪比10的坑里没爬出来，我想对这些同仁说：“我们的躯体可以被束缚，但是思想不能被禁锢。”
3、 定量限为试样中被测物能被定量测定的最低量，找出这个值有意义吗？
提供杂质检测的结果时，结果的接收方一般不关注方法能检出的最低量，大多数只关注实测值或者是否超过限度，因此在实际检测过程中，报告的杂质检测结果小于一定的值之后就很可能没有了意义，如原料药有关物质检测结果，某杂质限度为0.1%，报告的实际检测结果为“0.0003%”与“小于0.02%”并没有实际上的差别，都足以让结果的接受方得出供试品中该杂质含量远低于限度要求的判断。因此ICH的相关指导原则中提出了报告限的概念，含量低于报告限的杂质在检测结果中可以不必报告具体检测值，如果遵循ICH相关指导原则的规定，确认分析方法在报告限浓度水平具有良好的灵敏度、精密度与准确度就足以满足实际检测需要。
由于定量限测不准原理的存在，被测物能被定量测定的最低量在实际检测工作中是不稳定的随机的值，因此方法验证中确定该值并无太大的实质上的意义。
一般来说，没有必要确定定量限，但是在某些情况下如药代动力学研究过程中，待测样品的含量可能是一个非常大的区间，对仪器与分析方法的定量限研究对于相关研究具有一定的指导意义，因此具有一定的积极意义，但仍然要充分评估各种条件变动对该值变化存在的风险。
定量限验证异常情况2：回收率不符合规定
最近逐渐兴起定量限需要做准确度验证的做法，中国药典2015年版四部通则9101对定量限概念的定义中明确提出定量限“其测定结果应符合准确度和精密度要求”，于是越来越多的人开始进行定量限浓度的回收率试验。
定量限浓度的回收率试验一般浓度小响应误差大，回收率经常不符合规定，这属于正常情况，可以理解；但是正常归正常理解归理解，可不符合规定就不符合指导原则要求的“测定结果应符合准确度要求”的定义，应该怎么处理呢？
1、放宽定量限回收率的可接受标准
以有关物质方法验证为例，如果其他三个浓度水平的回收率可接受标准为80%~120%，则将定量限回收率可接受标准放宽至70%~130%；这是目前较为常见的一类做法，是上文中提到的未彻底摒弃信噪比10规定的同仁较常见的做法，似乎非常合理，定量限响应低误差大，所以回收率相对放宽，很合理。但是…..事情总是有但是，从检测结果的准确度角度来看，是否可以认为定量限浓度水平的检测结果较其他浓度水平的检测结果更加不准确？对于检测结果准确度的要求可以这样随意更改吗？那以后定量限水平的检测结果是可信还是不可信？
如果深究的话，似乎放宽定量限回收率的做法也有一定的问题，而且这种放宽是非常随意没有什么依据的做法，由于该做法存在以上的矛盾，所以又有了另一种做法，如下：
2、提高定量限浓度
既然是由于浓度小响应误差大导致回收率不符合规定，那么提高定量限浓度也就增加了响应减小了检测误差，则可避免由此导致的回收率不符合规定的情况。这种做法常见于上文提到的彻底摒弃信噪比10规定的同仁，定量限水平的回收率可接受标准同其他浓度水平，即其检测结果的准确度同其他浓度水平。
该种做法的出现，可以说标志着定量限的概念已经千疮百孔、名存实亡。为什么这么说？因为在该浓度下的信噪比可能已经达到了好几百，远大于指导原则中对于信噪比10的要求，这个浓度与定量限还有多大的关系？只是以定量限的名义对方法的灵敏度是否符合检测要求的一次确认而已。于是笔者有了一个大胆的想法：
定量限验证的概念应被放弃，代之以基于风险的理解对方法的灵敏度进行判断
这种耸人听闻的观念应该会产生很大的冲击，一定会有许多同仁不能接受，毕竟存在了这么多年深入人心的定量限概念，笔者竟敢信口开河说要彻底放弃，俗语说癞蛤蟆打哈欠—恁大的口气！如果上文的内容还不足以说明定量限概念的不合时宜，笔者下文将会给出对定量限的致命一击。
定量限概念的不严谨与局限性，给实践带来了各种各样的困扰，上述验证的各种问题只是其中一个方面，另一个方面体现在日常检测工作中。定量限概念中要求“其测定结果应符合准确度和精密度要求”，这句话的本意是低于定量限的结果准确度与精密度皆不可知，从严谨的态度出发，日常检测过程中，低于定量限的检测结果不应被出示，也就是说如果某组分的实测结果小于定量限，在COA中不得出现数值的表现形式，而应表达为“小于定量限”。该要求有其先进性，但是它的局限性在于定量限测不准，也就是说日常检测过程中不能知道定量限的具体值。或许有同仁会反驳说，QC实验室在做方法转移或者方法确认时会验证定量限，同上文所述，方法转移或者方法确认的定量限数据能适用所有的状态吗？
结合以上两种情况，我们已经知道定量限的概念对验证与日常检测都带来了无法逾越的障碍，所以它必须被彻底放弃，我们不提定量限不管信噪比10，我们只研究方法能达到的风险较低的具有准确度与精密度的最低允许的检测结果，即方法的灵敏度应当符合要求。以有关物质为例，如果某个组分的限度为0.1%，如果0.02%水平下在响应最差的仪器中信噪比仍然达到100，且回收率验证与精密度验证均符合规定，则可以认为该数字可以适用于今后的日常检测，即如果有小于0.02%的检测结果，在COA中表述为“小于0.02%”，如果方法中规定了报告限或遵循ICH相关指导原则中报告限的规定，且0.02%小于报告限，也可表述为“小于报告限”。
如果方法的灵敏度存在风险，应当在系统适用性试验中增加灵敏度的相关试验。以有关物质为例，如某组分的限度0.1%，方法验证时0.05%水平下信噪比20，回收率验证与精密度验证均符合规定，该水平为日常检测报告的最低值，则在系统适用性试验中应确认该组分0.05%水平下信噪比不小于20。
四、有关物质与残留溶剂专属性
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有关物质
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残留溶剂
残留溶剂的研究在某种意义上与有关物质类似，是对供试品中可能存在的溶剂进行系统的研究，包括已知的溶剂与未知的溶剂。在目前的专属性验证中，大多只是研究色谱图中已知溶剂峰之间的分离情况，忽略了未知溶剂的研究。由于现在采用的气相色谱柱大多为毛细管柱，具有非常高的柱效，一般情况下方法验证时溶剂峰之间的分离度不符合要求的情况较少（方法开发如何优化分离度不在本文论述范围），因此本文着重论述残留溶剂方法验证时出现的未知溶剂峰。
未知溶剂峰的来源一般主要从两个方面：样品本身与污染。
（1）样品本身引入的未知溶剂峰
样品本身引入的未知溶剂峰在方法验证期间需要进行细致的研究，说明其来源，必要时确认结构与性质，制定合理的限度；如不对该溶剂进行检测，应当具有合理的理由。
样品本身引入的溶剂峰来源一般有以下几个来源：副反应产物、降解产物与热降解产物。
API在合成过程中可能产生一些副反应产物为有机溶剂残留在供试品中，如酰氯遇醇的酯化物或某些基团脱落的小分子产物等，为避免方法验证时该类溶剂的干扰，应当在方法开发期间对这种可能的副反应产物溶剂进行系统的评估。方法验证期间，可通过GCMS确认其结构式，如为预期的副反应产物，且含量较高，应当订入质量标准，制定合理的限度。
某些降解产物可能为有机溶剂，应当订入质量标准，制定合理的限度。
如果供试品遇热不稳定，进行残留溶剂检测时的未知溶剂峰为热降解产物，则可通过相关实验与理论说明该未知溶剂峰为热降解产物，无需订入质量标准。必要时优化检测条件，避免热降解产物的产生。
（2）污染
污染产生的未知溶剂主要有两大来源生产过程与检测过程。生产过程可能引入未知溶剂常见于不同产品在同一干燥设备中干燥的交叉污染，检测过程引入的未知溶剂常见于供试品溶液与其他有机溶剂位置较近通过空气传播导致的污染等。由于这些情况并非技术原因，且有无数种可能性，通过相关管理制度可避免，本文不再详细论述。