注：文末有研究团队简介 及本文作者科研思路分析
氧化还原酶是仅次于水解酶广泛应用的生物催化剂，其中羰基还原酶能够催化可逆的羰基还原或醇氧化反应。与化学不对称氢化羰基化合物不同，酶催化反应不需要高压、低温等极端反应条件，在转化天然底物时，往往表现出极高的转化能力及立体选择性；但是在利用羰基还原酶还原非天然底物时，酶的转化能力差，产物的立体选择性低，限制了羰基还原酶在更多羰基化合物中的应用。
α-卤代芳香酮不对称氢化获得的手性醇是合成肾上腺素受体激动剂、支气管扩张药物、HIV-1蛋白酶抑制剂的关键中间体。利用羰基还原酶催化转化α-卤代芳香酮生成手性醇具有非常重要的应用价值。中国科学院天津工业生物技术研究所的生物催化与绿色化工（朱敦明、吴洽庆）研究团队对来源于赭色掷孢酵母（Sporobolomyces salmonicolor）的羰基还原酶SSCR的改造和合成应用开展了系统的研究，发现SSCR对α-卤代芳香酮化合物具有很高的催化活性，尤其是对α,α,α-三氟甲基苯乙酮的酶活力与苯乙酮的酶活力相比提高了1000倍，同时获得的手性醇ee 值从42%提高到> 98%。苯乙酮是α-卤代芳香酮的结构类似物，结构差别在于羰基的α位取代基不同。如何在分子水平理解酶分子氨基酸残基与α-卤代芳香酮α-取代基团之间的相互作用，导致SSCR对α-卤代酮底物的活力、立体选择性显著提高呢？
该团队通过计算模拟发现，在SSCR活性中心α,α,α-三氟甲基苯乙酮底物两侧的六个氨基酸（N207、Y208、T209位于三氟甲基一侧；S222、T223、S224则位于苯环一侧）与底物的相互作用可能是导致高活性和立体选择性的原因。
图1. 底物α,α,α-三氟甲基苯乙酮与酶分子氨基酸残基的相对位置
作者通过对上述六个氨基酸分别进行丙氨酸突变，获得了六个突变体，检测这六个突变体对α-卤代芳香酮的活性和立体选择性。结果表明，固定三氟甲基基团的关键氨基酸残基是207位的天冬酰胺，三氟甲基中的氟原子与207位天冬酰胺上酰胺基的氢原子形成氢键，氢-氟原子之间的距离仅为2.35 Å。将207位天冬酰胺突变为丙氨酸后，突变酶的活力下降为野生型的20%，产物的ee值也降低至93%。固定苯环的关键氨基酸残基为222位丝氨酸和223位苏氨酸，222位丝氨酸和223位苏氨酸上羟基的氢原子与苯环形成XH/π相互作用。这两个氨基酸残基分别突变为丙氨酸后，对突变酶的活力影响不大，但是产物的立体选择性均下降至81%。因此，氟原子与207位酰胺基氢原子氢键破坏导致催化活性大幅度降低，而222位丝氨酸、223位苏氨酸与苯环形成的XH/π相互作用消失导致立体选择性下降。
图2. SSCR催化α,α,α-三氟甲基苯乙酮（1g）的还原活性和立体选择性控制的分子机理
该研究从分子水平揭示了羰基还原酶催化α-卤代酮（α,α,α-三氟甲基苯乙酮）还原反应的活性和立体选择性的控制机理，通过对羰基两侧取代基团与酶相互作用的操控，能够有效对酶的催化活性和立体选择性进行干预，从而为羰基还原酶的设计改造指明方向。这一成果近期发表在ACS Catalysis 上，文章的第一作者是中国科学院天津工业生物技术研究所的副研究员陈曦和助理研究员张红榴。
该论文作者为：Xi Chen, Hongliu Zhang, Jinhui Feng, Qiaqing Wu, Dunming Zhu
原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：
Molecular Basis for the High Activity and Enantioselectivity of the Carbonyl Reductase from Sporobolomyces salmonicolor toward α-Haloacetophenones
ACS Catal., 2018, 8, 3525, DOI: 10.1021/acscatal.8b00591
朱敦明研究员简介
朱敦明，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员、工业酶国家工程实验室副主任、天津市生物催化技术工程中心主任，中科院百人计划和天津市千人计划入选者；1987年毕业于中国科学技术大学，1993年获得中国科学院上海有机化学研究所博士学位；2009年加入天津所之前任职于美国的大学和生物技术公司。
朱敦明的研究领域为生物催化与绿色化工，即新型工业酶的发现、改造、生物催化机理及其在化学工业中的应用研究以及生物催化二氧化碳固定化的反应机理及其高值化利用；在J. Am. Chem. Soc.、Chem. Sci.、ACS Catal.、Adv. Synth. Chem.、Appl. Environ. Microbiol. 等刊物发表研究论文100多篇，邀请综述和专著章节10多篇；申请专利20多项，授权7项，开发了天冬氨酸绿色生产工艺、关键甾体药物中间体的生物合成和手性醇药物中间体及非天然氨基酸生物合成平台技术等，其中天冬氨酸、关键甾体药物中间体和手性醇药物中间体成果已经完成技术转让并应用于工业化生产；应邀在Gordon Research Conferences的Green Chemistry和Biocatalysis两个主题研讨会以及Engineering Conference International的Enzyme Engineering Conference等国际著名学术会议做大会邀请报告。
http://www.x-mol.com/university/faculty/49672
科研思路分析
Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？
A：α-卤代芳香醇是一类重要的药物中间体，利用羰基还原酶催化转化α-卤代芳香酮生成手性醇具有非常重要的应用价值，很多企业寻求我们提供这方面的技术合作。我们研究的最初目的是获得高活性、高立体选择性的羰基还原酶，实现这类手性醇的高效合成。结果发现，SSCR对α-卤代苯乙酮和苯乙酮的催化活性和立体选择性具有如此大的差别，而且与文献报道的一些结果影响趋势相反，由此激发了我们继续探求导致SSCR对α-卤代酮底物活性、立体选择性显著提高的内在分子机制。
Q：研究过程中遇到哪些挑战？
A：针对实际应用的需求，如何快速地对酶分子进行设计改造，获得实现目标反应的高效酶催化剂仍然是酶工程和生物催化领域的一个重大挑战。
Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？
A：该研究在理论和应用方面均有应用。在理论方面，研究成果表明，酶分子活性中心的氨基酸与羰基底物的相互作用方式决定了酶分子在转化底物时表现出的活性和立体选择性，需要同时考虑羰基两侧的取代基团，为羰基还原酶的分子改造，达到提高酶活性和立体选择性的双重目的指明了方向。
该成果涉及高光学纯度的手性醇制备，对于化工领域的企业来说，当生产过程中涉及到手性化合物的合成，尤其当底物的结构特殊，具有多个官能团时，传统化学转化需要保护基修饰、保护基消除的步骤。生物催化的方法能够表现出其优异的化学选择性、区域选择性和立体选择性。我们在生物催化和绿色化工领域已经建立了先进的技术平台，利用蛋白质工程技术获得了实现多类羰基化合物高效还原的酶催化剂，促进精细化工行业的节能减排、转型升级，为企业创造价值。
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