何为鬼峰及其产生原因。所谓鬼峰就是英文“ghost peak”意译来的，指的色谱图中有时出现但和测定样品没有任何关系的峰。液相色谱中鬼峰产生的原因主要有如下几个方面。1）试剂问题，比如水、甲醇、乙腈、缓冲盐、酸、碱等。2）仪器问题，比如仪器管路中滋生的细菌、仪器故障引起的压力波动、脱气不全产生的气泡、色谱柱被污染、定量环被污染、针座被污染等。3）实验过程的操作问题，比如实验器具被污染、处理样品时的器具带入、实验室特殊环境等。
项 目 分 析 方 法 概 要
项 目 分 析 方 法 概 要
该制剂为小规格制剂，规格为0.2mg，处方中辅料与原料比例约为800:1。该品种的任何一个国家药典标准中均没有订入有关物质检查项，但药品注册申请期间需要进行有关物质的研究。参考原料的有关物质检查方法，USP、EP、JP等基本一致，都是根据主药前和主药后的杂质，采用两个不同洗脱能力的等度方式测定有关物质，也就是说这个有关物质测定需要分别用两个方法测定，再汇总。此法较烦琐，因此我们制剂方法将两个方法合二为一，即先等度后梯度，有机相为乙腈，水相为pH2.0的高氯酸氢氧化钠溶液。
项 目 碰 到 的 诸 多 “小 鬼”
项 目 碰 到 的 诸 多 “小 鬼”
流动相试剂带入
对于梯度洗脱，如果流动相中存在微量非极性杂质，会在柱头和色谱柱中蓄积，随着有机相比例的增加，这类非极性杂质会被洗脱出来，在色谱图中表现为鬼峰，即所谓的梯度洗脱峰。如因为色谱柱被污染、定量环被污染、针座被污染等原因产生的梯度洗脱峰会随着连续进样空白溶液，而逐渐降低。该项目在测定有关物质时，在有机相比例提高的后半段也会出现鬼峰，刚开始也是通过连续进针空白溶液的方式消减，但基线仍然不够平滑，表明梯度洗脱峰也可能是由流动相引入。配制流动相所用试剂中，乙腈是HPLC梯度级，水是高纯水，高氯酸是优级纯，氢氧化钠是分析纯，且水相经过0.22µm微孔滤膜滤过，试剂方面已没有改善的空间，其实一些微量的非极性杂质已经溶进流动相中已无法去除。后来在Purge阀和六通阀之间加装了一根某品牌的流动相杂质捕集小柱，整个基线平滑，堪称完美，此小柱用了很久基线依旧平滑。
滤膜材质带入
在该项目日常检测过程中，发现供试品溶液在基线后半段（此时乙腈比例约70%）有一杂质忽大忽小，毫无规律可循。后经排查，这个杂质是在过滤样品时由滤膜带入的，有机膜中尼龙膜和聚氟乙烯膜均在同一位置引入杂质。该杂质应该是滤膜材质中某种非级性化合物，当随着有机相比例的增加流动相的洗脱能力也相应增强，这些在色谱柱上蓄积的微量杂质会随着流动相而洗脱出来，该杂质平均占比约0.1%。当初也考察了弃去不同体积的初滤液，结果显示随着弃去体积的增加，此杂质有增加的趋势，可能滤膜材质中的该成份洗出量增加了。由于滤膜会带进杂质，因此该供试品的处理改成了离心处理。
塑料滴管带入
曾经10年前还用着的玻璃滴管，目前在各个公司的大小实验室里几乎难觅踪迹，因为塑料滴管使用便捷还不易碎裂。该项目有关物质的日常检测过程中，发现曾经完美的基线偶尔也会在基线尾段陆续出现好多小峰和大峰，又再次陷入困惑中。空梯度运行，基线完好，表明捕集小柱没问题。排查了好多溶剂，当用塑料滴管吸取水、天地的乙腈和默克的乙腈时，发现这两个品牌的乙腈都会带入杂质，所以曾经一度怀疑是色谱级乙腈惹得祸。折腾了好久，最终发现竟然是死在了这种一次性塑料滴管手里。本人有个习惯，虽然这是一次性塑料滴管，但总是洗洗反复使用舍不得用一次就扔了，直到滴管破了才会扔掉，所以这种鬼峰只是偶然出现，每次在使用新滴管时，也就是吸液的短短几秒内，塑料滴管中的杂质进去了，在色谱图中体现出来。这种目前各个公司大量使用的塑料滴管怎么成了罪魁祸首了？无语啊。后来细想，这种塑料滴管只有当吸取有机溶剂时才会将材质中的成份带入溶液，且均为非极性化合物，基线尾段随着洗脱能力的增强才被洗脱出来。如果说梯度后段的有机相比例不够的话，这种杂质还未必出得来，有可能蓄积在色谱柱中，最后在冲洗色谱柱时当用高有机相时才会洗出。
离心管带入
上述中说是样品的处理改成了离心，但正是这个离心过程中使用的塑料离心管也成了罪魁祸首。样品检测时，发现有两处的杂质忽大忽小，毫无规律。曾一度怀疑是辅料中的某些成份，因提取主药的时候而提取出来，这种提取率可能是忽大忽小的。做实验真得要具备怀疑精神，后来发现这两个鬼峰竟然是离心管带入的，实验室里有两个品牌的离心管，当使用其中一个品牌时，此两处的杂质虽然也有但小到忽略不计，当使用另一个品牌的离心管时，就大得很，有时比供试品中的杂质还大，且每个离心管的杂质引入量不一，所以会忽大忽小。市面上的玻璃离心管很少，即使有，跟我们的离心机孔眼深度也不匹配，且玻璃离心管也经不起高速离心，会碎裂。考虑到这种塑料离心管中带入的杂质都是些非极性化合物，因此我们使用乙醇浸泡超声清洗，终于将这两个小鬼干掉。
思 考
思 考
这个项目的有关物质检查过程中，被诸多“小鬼”困扰，排查问题时排得一度怀疑人生，曾经使用的塑料滴管和塑料离心管怎么突然变得面目狰狞。痛定思痛，细思量，这个跟该品种是小规格制剂有关。处方中辅料与原料比例约为800:1，供试品中主药浓度很难上得去。该品种有关物质供试品溶液中主药浓度为40µg/ml（通过加大进样量能满足杂质检出能力），而大规格制剂中主药浓度一般是这个浓度的10倍以上，那些在小规格制剂中占比0.1%的鬼峰在大规格制剂中会相对地缩小10倍，完全忽略不计了。那些塑料材质或试剂中微量的杂质本来可以忽略的，却在小规格制剂中跟供试品中杂质量相当，平起平坐，开始兴风作浪。
后 言
本文提示，在我们日常实验时，手里拿着的实验器具尤其是看起来相当洁净的塑料器具可能存在引入杂质的风险。即使是一次性器具，使用前进行彻底清洗还是有必要的。前车之鉴，后车之师，各位同仁在实验过程中碰到类似问题时可以借鉴。不管怎样，在杂质检查时，需要评估塑料器具引入干扰杂质的风险，以免被“小鬼”纠缠。
——END——
同写意论坛：
是一个开放，由自愿者组成的团体，由以下成员组成：Voyager88，雷诺岛，Herman，梅希，文竹，duke，占小兵，锦心绣口，多巴胺，瑜儿，子炎，克格莫，Sophia ，偶阵雨，零下274℃，Helen，等等，ZMJ，润儿，云卷、二友木、羊羊、wonger、Jerry、Admiral、圣手小毒物、魔鬼深白色、郭大侠、萧月、氢气发生器、谁、贝壳里的乾坤、Freesky和曾文亮。欢迎有志之士加入我们团队。投稿、合作、加专业群请加微信437180999，二千人QQ群22711855。
责任编辑：雷诺岛