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制药企业生产环境中污染葡萄球菌菌种鉴定方法的比较评价及毒素基因调查分析
Species Identification Analysis by Different Methods and Toxin Genes Detection of Staphylococcus Strains Isolated from Drug Manufacturing Enterprises
李琼琼，宋明辉，秦 峰，刘 浩，杨美成*
(上海市食品药品检验所，上海 201203)
摘要：比较评价16S rRNA 序列比对、VITEK 2 Compact 微生物鉴定系统和RiboPrinter 鉴定系统对制药企业生产环境中分离的92 株葡萄球菌菌种鉴定的准确性，研究12 种毒素编码基因在制药企业生产环境污染葡萄球菌中的分布规律。结果表明92 株葡萄球菌均为凝固酶阴性菌，可分为8 个葡萄球菌菌种，其中表皮葡萄球菌污染率最高(27.2％ )。16S rRNA序列比对分析不能有效区分头状葡萄球菌和山羊葡萄球菌，RiboPrinter 鉴定系统易把假中间葡萄球菌错误鉴定为中间葡萄球菌，而VITEK 2 Compact 鉴定系统对头状葡萄球菌、人葡萄球菌、巴氏葡萄球菌和科氏葡萄球菌中的部分菌株存在不能有效鉴定或鉴定错误。在92 株凝固酶阴性菌中共检出7 种毒素基因(pvl，sea，seb，sec，sed，egc 和eta)，其中杀白细胞毒素基因pvl 的检出率最高(8.70％ )，其次为肠毒素基因sec(6.52％ )。综上所述，16S rRNA 序列比对分析和RiboPrinter 鉴定系统对不同种葡萄球菌的鉴定准确性优于VITEK 2 Compact 鉴定系统。制药企业生产环境中污染的凝固酶阴性葡萄球菌具有一定潜在致病性，今后在药品微生物检验与生产过程中应加强对凝固酶阴性葡萄球菌的监控。
关键词：制药企业；微生物污染；葡萄球菌；菌种鉴定；毒素基因
微生物污染是制药企业生产过程控制及药品质量评估的重要指标，也是影响消费者用药安全的关键因素[1]。2015 ～ 2017 年美国FDA 公布的药品召回事件中，由微生物污染风险引起的召回事件占到了49％以上[2]。因此加强药品生产过程微生物监管和风险控制是保障药品质量、降低用药风险的重要途径[3]。研究表明，葡萄球菌(Staphylococcus)特别是凝固酶阴性葡萄球菌是污染药品生产环境的主要微生物，占全部污染微生物的50％以上[4—5]。研究表明，凝固酶阴性葡萄球菌也极易造成临床感染，且容易获得和传递耐药性[6—7]，给治疗临床上相关感染带来极大的困难。因此，在药品生产的微生物质量控制中，实现凝固酶阴性葡萄球菌“种”水平的准确鉴定，对控制药品质量以及保障消费者用药安全具有重要意义。
随着分子生物学技术的快速发展，微生物鉴定技术也得到飞速发展。目前细菌鉴定方法主要分为表型鉴定技术和基因型鉴定技术。基因型鉴定技术相对于表型鉴定技术更稳定可靠，是细菌鉴定技术发展的主要趋势。基因型鉴定技术如16S rRNA 序列比对方法和RiboPrinter 微生物基因指纹鉴定系统，可以鉴定多数细菌，已得到广泛应用[8—9]。但有研究表明，16S rRNA 序列比对方法和RiboPrinter微生物鉴定系统，对一些近缘菌种有一定的鉴定局限性[10—11]。此外，近年开发的微生物生化鉴定系统如VITEK 2 Compact，使细菌鉴定过程更加趋向自动化。生化鉴定方法对常见微生物鉴定结果尚可，但对环境污染物往往不能有效鉴定或鉴定结果报告为低分辨率[12]。越来越多的实验数据表明，采用单一细菌鉴定方法往往存在鉴定准确率不足或鉴定菌种范围有限的问题，而将多种细菌鉴定方法及相关信息整合在一起，可以有效保障检验结果的准确性[13]。
本研究选择目前主流的细菌鉴定方法16SrRNA 序列比对方法、RiboPrinter 微生物基因指纹鉴定系统和商品化的VITEK 2 Compact 微生物生化鉴定系统，比较3 种细菌鉴定方法，评价其对制药企业生产环境中污染葡萄球菌菌种鉴定的准确性，为政府和制药企业建立可靠的葡萄球菌多相分类鉴定方法提供参考。同时，研究12 种重要毒素基因在制药企业生产环境污染葡萄球菌分离株中的分布情况，为药品监管和制药企业完善微生物监控体系提供依据。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 16S rRNA 序列比对微生物鉴定与分型
2.2 VITEK 2 Compact 微生物鉴定与分型
2.3 RiboPrinter 微生物鉴定与分型
2.4 葡萄球菌常见毒素基因的检测
3 讨论
中国药典2020 年版编制纲要突出强调了药品生产全过程中微生物控制的重要性，实现药品生产过程中污染微生物的准确鉴定是药品质量控制的重要组成部分。本研究以上海地区制药企业主要环境污染微生物葡萄球菌为对象，通过多种细菌鉴定方法的比较评价，以期建立制药企业环境污染葡萄球菌的多相分类鉴定方法。
越来越多的研究结果证明细菌基因型鉴定方法比生化鉴定方法更加稳定可靠，已逐渐成为细菌鉴定的主要技术手段[15]。本研究结果表明基于基因型鉴定的16S rRNA 基因序列比对和RiboPrinter 基因指纹鉴定系统对不同葡萄球菌菌种的鉴定准确性明显优于基于生化分析的VITEK 2 Compact 微生物鉴定方法。16S rRNA 基因序列比对可将除头状葡萄球菌和山羊葡萄球菌外的其他葡萄球菌准确鉴定到“种”。RiboPrinter 基因指纹鉴定系统也可对除假中间葡萄球菌外的其他葡萄球菌给出准确到“种”的鉴定结果，同时对同一菌种的菌株也显示出了较强的分型能力，可用于制药企业污染葡萄球菌的鉴定及溯源调查分析。而VITEK 2 Compact 细菌鉴定系统，对多达4 种葡萄球菌( 头状葡萄球菌、人葡萄球菌、巴氏葡萄球菌和科氏葡萄球菌) 的部分菌株存在不能有效鉴定或鉴定错误的结果。
研究表明制药企业生产环境中污染微生物大部分都是由人员带入，药品生产环境中污染的葡萄球菌以人源性凝固酶阴性葡萄球菌为主，如表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌等[16]。因此药品生产企业应加强生产人员的无菌操作意识，加强生产环境消毒，从源头杜绝微生物污染。本研究毒素基因调查结果显示，7 种毒素基因在凝固酶阴性葡萄球菌中均有分布，其中与人体皮肤软组织化脓感染相关的杀白细胞毒素编码基因pvl 的检出率最高，多种能够导致肠炎的肠毒素编码基因( sea、seb、sec、sed 和egc) 也在凝固酶阴性菌株中有所检出[17—18]，表明药品企业生产环境中污染的凝固酶阴性葡萄球菌具有一定的潜在致病性。此外，毒素基因多样性分析结果显示，表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌中的毒素基因阳性菌株明显多于其他葡萄球菌，且存在同时携带多种毒素基因的菌株，表明表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌的潜在致病性强于其他凝固酶阴性葡萄球菌。
综上所述，任何单一细菌鉴定方法都不能实现所有葡萄球菌的准确鉴定，多种细菌鉴定方法相结合更能获得准确可靠的结果，保证检验结果的准确性。毒素基因调查结果表明制药企业环境污染凝固酶阴性葡萄球菌具有一定潜在的致病性，未来应加强对药品生产环境中污染凝固酶阴性葡萄球菌的监控。
作者简介：李琼琼(1986—)，女，硕士，主管药师，从事食品药品质量控制及微生物快速检测。
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通信联系人：杨美成(1972—)，女，博士，主任药师，从事食品药品微生物检验与实验室质量管理。
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