来源于CHO表达系的生物技术产品的具有存在病毒污染的危险性，这种污染会在临床中导致严重后果，污染可能来源于原细胞系本身，也可能来自生产过程中偶然带入的外源病毒，为了保证生物技术制品的安全，需要在生产过程中对病毒进行消除和灭活以降低每剂量中的病毒样颗粒含量至一定标准。
包括膜过滤和柱层析法等，前者通过孔径大小拦截病毒，对消除倾向于聚集的病毒有效；后者根据病毒和目标蛋白在填料中的不同结合或流穿方式，从而消除蛋白溶液中的病毒。
1.1 膜过滤
可分为直流过滤技术和切向流过滤技术，前者通过深度孔径拦截使蛋白分子与病毒颗粒得到有效分离，如图 1所示；后者通过表面孔径拦截使蛋白分子与病毒颗粒得到有效拦截，如图 2所示。但膜过滤只对滤膜的孔径比病毒有效直径小才能有效消除病毒，一般来说不能单独使用，需要与其他方法联合使用。
图1 直流过滤模式
图2 切向流过滤模式
1.2 柱层析法
柱层析法根据蛋白质的理化性质的不同进行蛋白分离纯化，从而达到分离杂蛋白及消除病毒等污染物的问题，柱层析法包括亲和层析、离子交换、反相层析等。
只有能够部分破坏病毒结构或活性，并维持生物技术药物理化性质及生物学活性的方法才是最理想的方法，例如有机溶剂/去污剂（S/D）处理灭活病毒、低pH孵育法灭活病毒，
2.1 有机溶剂、去污剂（S/D）处理灭活病毒
有机溶剂如磷酸三丁酯（TnBP）和非离子化的去污剂如TritonX-100或吐温80结合可以灭活脂包膜病毒，但对非脂包膜病毒无效，S/D处理前需先用1µm或更小孔径的滤器去除蛋白溶液可能存在的颗粒（颗粒可能藏匿病毒从而影响病毒灭活效果），加入S/D后需确保是均一的混合物，灭活病毒全过程应将温度控制在规定的范围内。如果加入S/D后立刻过滤，则需检测过滤后S/D的浓度是否发生变化，如有变化应进行调整。
2.2 低pH 孵育法灭活
当使用低pH条件灭活病毒时，灭活条件如pH、孵育时间、温度、蛋白质浓度、目标蛋白中的病毒分散形式等均会影响病毒灭活效果。
虽然目前以逆转录病毒的清除能力作为抗体或者融合蛋白的病毒清除验证指标，只有达到指标，方能进入一期临床实验（FDA,1997），并且每种病毒在早期和后期除病毒验证时的使用频率不同，在IND阶段，逆转录病毒、细小病毒和疱疹病毒处于主导地位。但在NDA和BLA阶段，会使用3-5种模型病毒，使用呼肠孤、小核糖核酸病毒、多瘤病毒等其他种类病毒的比例会增加。
对于表 1中所含四种病毒的性质在不同的书中展示的pI或大小会有差异，但基本一致。包膜病毒表面为重复的蛋白质和糖蛋白，主要由对称的二十面体壳组成，由于结构单一，所以这些包膜病毒具有类似的行为特点，但是不太确定体积、硬度以及对称性的改变会不会影响不同包膜病毒的性质。
表1 常用病毒性质
|
病毒 |
类型 |
性质 |
pI |
|
X-MuLV |
逆转录病毒 |
包膜，ssRNA，80-120 nm |
6.0-6.7 |
|
MVM |
细小病毒 |
无包膜，ssDNA，18-26 nm |
5.0 |
|
PRV |
伪狂犬病毒 |
包膜，dsDNA，120-200 nm |
7.4-7.8 |
|
Reo-3 |
呼肠孤病毒 |
无包膜，dsRNA，50-70 nm |
3.9 |
但是对大规模生产的病毒灭活和病毒消除能力的研究，由于受限于可提供研究的病毒量及其他条件，只能采用使用缩小规模生产的办法来进行研究，其中一种方法是对每一个操作单元采用真正线性放大的缩减规模的模式，使其提供的数据足以代表大规模生产的情况，以此研究来确保生物技术产品的安全性，采用此模式进行清除病毒研究，首先是设计并规范小规模生产过程的模型，并尽可能接近实际生产水平，例如，柱床高度、流速、载量、保留时间、缓冲液用量、填料型号、pH、温度、蛋白浓度、溶液离子强度、过滤速度、压力和过滤量。
目前国内常用的病毒清除验证实验的方案表 2。
表2 病毒清除验证方案
|
工艺 |
一期申报 |
三期申报 |
|
|
NMPA |
EMPA, TGA, US FDA |
EMPA, TGA, US FDA |
|
|
低pH病毒灭活或去垢剂灭活 |
2种病毒（MuLV， PRV），三批，动态曲线 |
1种病毒（MuLV），1批GMP，重复实验 |
2种病毒（MuLV， PRV），重复实验 |
|
纳滤 |
2种病毒(MVM， Reo-3），三批，中间取样 |
2种病毒（MuLV， MVM），1批GMP，重复实验，MVM实验中需要中间取样 |
4种病毒（MuLV， MVM，Reo-3，PRV），重复实验，MVM实验中需要中间取样 |
|
阴离子交换层析 |
NA |
2种病毒（MuLV， MVM），1批GMP，重复实验 |
4种病毒（MuLV， MVM，Reo-3，PRV），重复实验，评估设定的最大使用次数时的填料 |
|
另外一种层析步骤 |
NA |
选择另外一种层析步骤 |
4种病毒（MuLV， MVM，Reo-3，PRV），重复实验，评估设定的最大使用次数时的填料 |
5.1 澄清深层过滤
虽然澄清深层过滤膜具有大表面积及吸附性的表层的特点，并且能吸附培养上清液中的杂质从而提高下游的纯化效率，有文献（AbhinavA Shukla, 2015）指出，使用A1HC和Cuno90ZA进行澄清深层过滤，可以达到2- 4LRV的病毒消除能力，但是目前深层过滤未被选用于病毒清除验证实验中，部分原因是深层过滤是在低压下进行实验，实际操作中流体分布和小规模的膜中的分布是否一致，是否能够稳健的用于病毒清除验证尚未可知。
5.2 亲和层析
根据文章（Luteet al.,2008）中研究，使用亲和层析消除病毒主要依靠病毒在亲和填料中和其他非目标蛋白的杂质发酵液成分一起流穿，并且不受填料寿命的影响，另外一篇文章（Georgeet al.,2010）中指出，亲和层析消除病毒的能力也受各种亲和工艺参数（载量、缓冲液体系、保留时间等）的影响不大，但是培养收获液的浓度或者类型对其影响较大（titer高低、分子序列等）。当病毒非特异性的吸附到填料或和目标蛋白，可能会降低病毒清除的能力，
从图 3(a)中可以看出，使用亲和层析消除逆转录病毒的能力约70% 维持在4 – 6LRV，但从Kathryn等人的文章中可以看出，亲和层析消除X-MuLV的平均水平2.98LRV，消除MMV的平均水平为2.32LRV。MinZhang的文章中指出亲和层析消除X-MuLV和MMV的能力具有同样的趋势，比如，当消除X-MuLV的能力提高时，消除MMV的能力同样提高，但是总体来说，消除X-MuLV的能力大于消除MMV的能力，大约高0.7LRV。
Scott Lute等人通过不用的清洗方法对不同亲和层析填料进行清洗，并对使用前后的填料进行比较，所用的模型病毒为X-MuLV,SV40及MMV，研究表明，新的亲和填料和多次使用后的亲和填料在病毒消除能力并无差异，总而言之，亲和填料使用后并不影响清除验证效果。但欧洲国家对这个结论持不肯定态度，需要和相关部门进行讨论。
5.3 阴离子交换层析（流穿模式）
阴离子交换层析（流穿模式）能够有效消除具有包膜和非包膜的病毒大于4LRV，从图 3(b)中可以看出约有34%的案例，使用阴离子交换层析消除逆转录病毒的能力维持在5- 6 LRV。消除X-MuLV的平均水平4.22LRV，消除MMV的平均水平为3.25LRV。
Strauss等在文中指出上样样品的pH和电导率会影响阴离子交换层析（流穿模式）消除病毒的能力，文中使用QSFF和SFF（不含有带电基团）填料，某种单抗（pI大于8.0）作为研究蛋白，并使用X-MuLV,SV40及MMV作为模型病毒，并以pH8.0不同盐浓度作为研究条件，从图 4(c)中可以看出，在实验条件下，带季铵（QSFF）的填料比不含带电基团的填料具有更高的去病毒的能力，研究得出阴离子交换层析消除病毒的能力主要是由于静电作用作为主导作用，因为在pH8.0条件下，病毒带负电荷，可以和带正电荷的季铵阳离子结合，从而达到消除病毒的作用，但是这种静电作用会被高盐条件打破，从图 4(a)中可以看出，当上样盐浓度从25mM升高至1 MNaCl时，三种病毒的消除能力均下降，X-MuLV从4.6LRV降为1.0LRV，SV40从4.2LRV降为了1.0LRV，MMV从4.8LRV降为了0.1LRV，从图 4(b)中可以看出，当上样电导率增至50mS/cm时，病毒消除能力降低至1.0LRV以下，从而说明静电作用会被高盐条件打破。另外一篇文章中（CurtisS,2003），以QSFF作为层析填料，SV40作为模型病毒，商业化生产中的三种抗体为目标蛋白，通过对层析过程柱高，线性流速，上样载量，pH及电导率的研究，得出结论，当线性流速76-600cm/h，缓冲液体系为Tris-base体系，操作温度为室温，层析柱高≥11 cm，操作载量为≤250 g/L时，可消除SV40达到≥4.7 LRV。
LisaConnell-Crowley（2013）等使用Tecan进行高通量筛选，确认pH对阴离子层析的影响小于NaCl（盐浓度）对阴离子层析去病毒的影响。实验中使用QSFF和Captoadhere作为实验材料，X-MuLV作为目标病毒，研究发现，静电作用是促使病毒结合于阴离子填料的主要原因，对于QSFF，低盐条件（≤100 mM NaCl）能够达到较高的消除效果。对于Captoadhere填料，同样是静电作用占据主要原因，但是疏水作用，氢键也发挥作用，相对于QSFF，Captoadhere在含有200mM NaCl中消除病毒的能力大于QSFF，也就是说Captoadhere更耐盐。同时实验也表明，样品中杂质的含量（HCP,DNA, HMW等）会和病毒竞争吸附Captoadhere和QSFF填料，从而导致消除病毒能力的下降。
5.4 阴离子交换层析（膜层析）
虽然目前阴离子交换膜层析在国内的使用并不广泛。但Miesegaes（2010）等人采用多家的阴离子吸附膜和阴离子层析填料进行比较，发现两者具有同等的病毒消除效果，例如两者大约消除X-MuLV达到4LRV，吸附膜的配基和病毒带电量对于消除效果影响较大，而流速、保留时间则对病毒的消除效果影响不大，
5.5 阴离子交换层析（结合模式）
图 3(d)中可以看出阴离子交换层析（结合模式）消除病毒LRV广泛分布于3- 7 LRV，图 5(c &d)展示了阴离子交换层析（结合模式）去病毒能力与pH和盐浓度的关系，从图 5(c)中可以看出，相对于上样/平衡和洗脱液之间同样的pH的实验中，两者之间有pH差异(0.6)有助于提高病毒消除能力，图 5(d)中展示了当上样/平衡和洗脱液之间盐浓度差异较大时不利消除病毒。George的文中指出，当目标蛋白的pI和病毒的等电点接近时，不利于病毒消除。
5.6 阳离子交换层析（结合模式）
从图 3(c)中可以看出，阳离子交换层析（结合模式）消除病毒的能力不均，约20% 能够消除1– 2 LRV，同时也有约8%维持在6 – 7LRV，但从Kathryn等人的文章中可以看出，阳离子层析消除X-MuLV的平均水平2.51LRV，消除MMV的平均水平为0.92LRV。图 5(a)中也可以看出，上样/平衡和洗脱时使用了低pH的缓冲液时，能够取得较高的LRV，从图 5(b)中可以看出，在上样/平衡和洗脱时使用较低的盐浓度，同时有助于提高病毒消除能力。
5.7 纳滤
从图 3(h&i)中指出，对于消除逆转录病毒，无论使用大孔纳滤膜还是小孔纳滤膜，均能达到2LRV以上的消除能力，但是对于细小病毒的消除能力，从图 3(j)中可以看出，使用小孔纳滤膜消除细小病毒，发现了低病毒消除能力的案例，可能是由于纳滤膜的类型造成的（文中并未指出使用了哪种纳滤膜），PDA（2008）中指出，使用小孔纳滤膜消除细小病毒要防止因过载而引起的流穿。
纳滤的载量和滤膜被污染的程度直接相关，在病毒清除验证时，病毒的纯度非常重要，纯度越高，病毒消除时的实际载量可能越高，并且通常情况下，MVM病毒的纯度高于X-MuLV，大小方面：MVM小于X-MuLV，因此纳滤消除病毒的效果可使用MVM的消除程度作为最差情况。
目前发现，Planova20N的纳滤膜的低载量可能是由于蛋白溶液引起的，例如蛋白溶液的聚体含量，这个可通过预过滤器实现。低压操作过滤（6.5psi）或者中间流速暂停，可能会造成病毒流穿，虽然目前这个现象未出现在BioEX滤膜中，但是低压情况的病毒清除验证效果，需要进行测定，并且若使用Planova20N，在病毒清除验证时，是否需要模拟生产中的实际流速状况，例如暂停，应引起足够重视。
目前存在一种猜想，在纳滤时，小孔径的膜包最先被杂质堵塞，导致病毒从大孔径流穿，这种优先堵塞原理，反映在流速衰减中，所以建议无论在病毒清除验证还是实际操作中，以流速衰减量作为结束终点，但目前大部分组织仍以体积载量作为终点。
5.8 低pH病毒灭活
常选用较弱的酸进行低pH病毒灭活，从而可防止高浓度的酸造成的局部浓度过高，导致产生聚体或者其他影响质量的可能性问题，弱碱溶液通常在步骤完成后用于中和，因为长时间暴露在低pH条件下是不可取的。图 3(c)中展示出约有41%的案例并不能完全清除病毒，pH是低pH病毒灭活的一个关键工艺参数，虽然Brorson等人指出pH3.8足够灭活逆转录病毒，并且根据George等人的文中指出在pH3.6或者更低的pH环境中方能保证病毒的灭活能力。溶液浓度是另外一个关键性因素，但是当溶液盐浓度≤500 mM NaCl，浓度≤40 mg/mL，pH≤ 3.8，可以达到消除≥4.6 LRV的逆转录病毒的效果。
目前对于低pH病毒灭活，具有一个待解决的疑问：由于容器顶部或者管道壁的液滴未能接受到很好的低pH病毒的灭活，这个问题成为“悬滴问题”，目前某些公司采取的方案是将混匀完成的溶液转移至另外一个容器中。
5.9 S/D病毒灭活
使用S/D进行病毒灭活影响因素众多，比如所使用S/D的种类、发酵液的温度、消泡剂的含量、浓度及其中杂质含量，首先S/D的种类很多，使用0.25%的TritonX-100孵育时间大于30min便可有效灭活病毒，当使用0.3%的TritonX-100室温孵育30min，可稳健消除病毒≥4 LRV，但是当发酵液温度较低时，TritonX-100的加入浓度需要做相应的调整。TritonX-100的使用会造成环境影响，所以目前需要慎用。另一种潜在的可用于病毒灭活的试剂为LDAO(Lauryldimethylamine N-oxide)，使用浓度为014%便可达到有效灭活脂包膜病毒。0.2%TnBP和 1%PS80联用用于灭活细胞发酵的产品中的病毒的案例不多，但其广泛用于于血浆制品中。无论使用LowpH进行病毒灭活还是使用S/D进行病毒灭活，虽然病毒的灭活效果显著，如果灭活能力LRV＜5.2，残留的感染性和对后续纯化步骤是否产生影响是需要考虑的问题，例如影响亲和层析的工艺效果，降低亲和填料寿命。上述低pH病毒灭活的“悬滴问题”同样适用于S/D病毒灭活，虽然液滴低落后，会被持续灭活，但是灭活的时间无法保证。
（1）文中提到的lowpH或S/D病毒灭活时的“悬滴问题”。
（2）当培养工艺改进后，收获液对亲和层析的病毒能力产生影响的程度。
（3）复合模式层析填料消除病毒的原理是否和疏水层析或者离子交换层析正交。
（4）每种病毒的重复实验中，两个病毒去除数值应该报道的两者中最优的一个，还是最差的一个或两者的平均值。
（5）目前倡导的连续流纯化工艺如何进行病毒清除验证，若在模型中在线加入病毒，并从中间取样进行病毒检测，但会被质疑样品是否均一，还是采用目前非连续模型，但使用每种工艺的最差条件进行病毒清除验证。
图3.申报材料中的各工艺去除LRV分布（截止2009））.每一个直方图代表每种清除能力的案例比例。(a)亲和层析, (b) AEX流穿模式, (c)CEX结合洗脱模式,(d) AEX结合洗脱模式,(e–g)低pH病毒灭活,(h) 大孔滤膜,(i and j)小孔滤膜.e: 病毒是否完全清除比例(lightgray) 和(darkgray) 病毒完全清除.a–i: 使用的是逆转录病毒;(j) 使用的是细小病毒.
图4.扰乱静电作用对病毒消除能力的影响。（a）QSFF Resin at 25 mM NaCl和1M NaCl，SFFbase resin（不含基团）at25 mM NaCl.(b)使用一种mab1作为原料，QSFF作为填料，病毒消除能力随电导率的变化趋势。（c）QSFF和SFFbase resin（不含基团）在电导率7mS/cm时的病毒清除能力。
图5.pH和电导率对AEX（结合洗脱模式）和CEX（结合洗脱模式）消除病毒的影响。a:CEX load和elutionpH对病毒消除的影响.b: CEX load和洗脱盐浓度盐浓度对病毒消除的影响.c: AEX load和elutionpH对病毒消除的影响.AEX load和洗脱盐浓度盐浓度对病毒消除的影响
参考文献：
1. Curtis S, Lee K, Blank GS, Brorson K, Xu Y.2003. Generic/matrixevaluation of SV 40 clearance by anion exchange chromatography inflow-through mode. Biotechnol Bioeng 84(2):179-186
2. G.R. Miesegaes, S.C.Lute, E.K.Read, and K.A. Boroson. 2013.ViralClearance by flow-through Mode Ion Exchange Columns and MembraneAdsorbers. American Institute of Chemical Engineers 30(1):124-131
3. Scott Lute, Lenore Norling, Michael Hanson et al.2008. Robustnessof virus removal by protein A chromatography is independent of medialifetime. Journal of Chromatography A,1205:17-25
4. Lisa Connell-Crowley, Elizabeth A. Larimore, Ron Gillespie. 2013.Using high throughput screening to define virus clearance bychromatography resins. Biotechnology Bioengineering 110(7):1984-1994
5. Kathryn Martin Remington, Robert Kelly, John Zehmer.2015. Viralclearance by protein A, anion exchange and cation exchangechromatography steps. American Pharmaceutical Review.
6. Min Zhang, George R. Miesegaes, Michael Lee et al. 2014. Qualityby design approach for viral clearance by protein A chromatography.Biotechnology Bioengineering 111(1):95-103
7. George Miesegaes, Scott Lute, Kurt Brorson. 2010. Analysis ofviral clearance unit operations for monoclonal antibodies.Biotechnology Bioengineering 106(2):238-246
8. Daniel M. Strauss, Scott Lute, Zinaida Tebaykina et al. 2009.Understanding the mechanism of virus removal by Q sepharose fast flowchromatography during the purification of CHO- derivedbiotherapeutics. Biotechnology Bioengineering 104(2):371-380
9. Abhinav A Shukla, Hazel Aranha.2015. Viral clearance forbiopharmaceutical downstream processes. Pharmaceutical Bioprocessing3(2): 127-138
Glen Bolton, Johannes Blumel.2016. Conference summary: Key discussionand outcomes, pending questions and proposed experiments. PDA J PharmSci and Tech 70：477-481
10. Jun zhi Wang et al. 3rd Version. Research, developmentand quality control of biopharmaceuticals.
11. ICH Q5A(R1): Viral safety evaluation of biotechnology productsderived from cell lines of human or animal origin.
培训推荐
识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！
请注明：姓名+研究方向！
版权为所有。欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权且在醒目位置处注明“转自：”。
