儿童对呼吸道合胞病毒的免疫应答

呼吸道合胞病毒（RSV）是1956年从圈养的黑猩猩体内分离出的一种有包膜的负链RNA病毒，属副黏病毒科，有两个主要的表面蛋白，F蛋白和G蛋白。RSV感染通常局限在呼吸道黏膜，一般不会进入血液或播散到其他器官，是造成儿童严重呼吸系统疾病最常见的病毒。目前，RSV仍然是造成5岁以下儿童严重呼吸系统疾病最常见的病毒，80％以上的孩子，两岁以内都至少经历过一种RSV感染。除了婴幼儿，RSV也可感染老年人，其引起的65岁以上人群的病死率接近于甲型流感病毒。RSV在全球每年大约造成340万人住院和至少66000人死亡。目前缺乏较好的治疗方案和安全有效的疫苗。

一、RSV的致病性

正常儿童针对RSV的免疫应答，还所知较少。因为RSV感染一般引起自限性疾病，这使得研究存在着不少伦理和现实问题。大部分儿童感染后仅显示轻度的上呼吸道感染或者偶发中耳炎，约1／3的儿童可发生下呼吸道感染，引起细支气管炎，主要是由炎性细胞浸润、黏液过度分泌、呼吸道上皮细胞坏死脱落以及气道壁水肿造成的。病毒主要在浅层气道细胞完成生命周期，这可能有助于其免疫逃避；病理组织学分析表明，该病毒主要是感染上呼吸道的纤毛细胞、小支气管上皮细胞及Ⅰ型肺泡上皮细胞，毛细支气管炎时有明显的炎性细胞浸润。也有报告显示，严重感染的发生与肺组织中病毒量大和淋巴细胞相对缺乏相关，病毒与宿主反应在细支气管炎发病中的地位仍有争议。

二、儿童对RSV感染的固有免疫应答

虽然人们已经认识到适应性免疫应答在抗RSV感染中的重要性，但是固有免疫系统对病毒的早期反应也有可能决定感染的后果。所以，两者的作用都不可忽视。目前，对肺部固有免疫力的产生、成熟及其影响因素知之甚少，肺的固有免疫系统很可能与全身免疫系统不同。婴幼儿呼吸道上皮细胞及其对病毒感染的反应是不同于成人的，广泛的上皮脱落与严重RSV疾病相关；呼吸道上皮细胞被认为是早期细胞因子的重要来源，细胞因子的产生、黏液的分泌及上皮细胞凋亡的程度均与感染病毒株相关；而且，鼻源性上皮细胞与下气道的上皮细胞的免疫反应是相似的。因此，可以用更易获得的鼻上皮细胞进行相关研究。

1.模式识别受体（PRR）的作用

机体早期对病毒的识别是通过上皮细胞、成纤维细胞和呼吸道的抗原呈递细胞（APC）的模式识别受体（PRR）进行的。这引起核因子－κB和干扰素调节因子（IRF）家族成员活化，导致细胞因子、趋化因子和抗病毒因子的表达上调。识别RSV的主要PRR是Toll样受体（TLR），如TLR4、TLR3、TLR2／6、TLR7／8等。TLR4基因敲除鼠的病毒清除能力和NK细胞的反应受损，提示TLR4在抗RSV的感染方面有重要作用。在人类，有两种常见TLR4基因缺失突变与鼻内细菌脂多糖的低反应性相关，这两种基因多态性被认为与婴儿发生严重细支气管炎有关。

TLR3在细胞内表达于RSV复制的过程中，用于识别双链RNA。与TLR4相反，TLR3敲除小鼠仍然可以有效地清除RSV，表现出杯状细胞增殖和过度的黏液产生，这可能导致婴儿发生严重的疾病。另外，敲除TLR8和TLR7的小鼠模型，也可加剧黏液的产生。但缺乏TLR7使得对RSV的T淋巴细胞应答向Th17细胞倾斜，Th17细胞与婴儿免疫病理的发生相关。Kollmann等使用脐带血与成人的血液细胞做TLR配体刺激实验，结果显示，成人和新生儿的反应存在显著差异，新生儿单核细胞产生更多的Th17型细胞因子，这可能有助于解释为何婴幼儿易患严重RSV疾病。

2.细胞因子的作用

病毒感染后，免疫系统产生促炎细胞因子和趋化因子。在感染RSV引起细支气管炎的婴幼儿支气管肺泡灌洗液中已发现了IL－6、TNF－α、CXC趋化因子配体（CXCL）10、IL－8、趋化因子配体（CCL）2、CCL3和CCL5。病毒感染早期，干扰素家族是一个关键的炎性介质。浆细胞样树突状细胞（pDC细胞），是α／β干扰素的有效生产者。新生儿pDC细胞在产生α干扰素和对RSV的反应上是有缺陷的，这增加了下呼吸道感染的风险。Ⅰ型干扰素（α干扰素和β干扰素）的受体可以诱导细胞抗病毒状态的形成；而RSV可以抑制α／β干扰素信号转导，破坏机体对病毒的有效清除。缺乏Ⅰ型干扰素受体的小鼠更易被RSV感染，但其产生的促炎细胞因子也减少，意味着Ⅰ型干扰素在响应固有免疫启动方面有重要作用。

3.免疫细胞的作用

（1）DC细胞和NK细胞：在感染的新生小鼠肺中DC的亚群是不平衡的，这些DC表现出较低的处理、提呈抗原的能力，使得RSV避免了有效的抗原提呈。NK细胞提供的γ干扰素，可以帮助激活DC和启动T淋巴细胞应答，并可直接杀伤受感染的细胞，新生儿NK细胞是未成熟的，NK细胞表达低水平的激活受体，产生较少的γ干扰素。对婴儿来说，严重RSV细支气管炎的发生和低NK细胞数相关。在动物模型中，RSV感染第3天后，NK细胞在支气管肺泡灌洗液中出现高峰，这对发展一个“适当”的T淋巴细胞应答，并避免产生Th2型应答和超敏反应起重要作用。

（2）中性粒细胞：在细支气管炎的早期阶段，中性粒细胞是被招募到气道的主要白细胞，中性粒细胞能破坏被感染的细胞，并释放损伤周围组织的酶。IL－8是很强的中性粒细胞趋化因子，已经证实，IL－8的启动子区域遗传多态性与婴儿的严重RSV疾病相关。在发生呼吸系统疾病婴儿的鼻灌洗液中检测到IL－8，且RSV阳性患儿IL－8水平高于RSV阴性患儿，还发现RSV感染住院的婴儿血清中IL－8和IL－6的水平高于健康对照组。不过，体外实验显示，这些细胞因子的产生与疾病的严重程度呈负相关。

三、儿童对RSV的适应性免疫

研究表明，儿童可以再感染相同的RSV株，但是第2次RSV感染的程度较低，表明自然感染可以产生部分保护性，但不能阻止RSV再感染。也有许多严重的疾病发生再次感染RSV，目前尚不清楚婴幼儿发生严重的RSV疾病是由于免疫系统不成熟还是由于初次感染。

1.儿童对RSV感染的体液免疫应答

（1）甲醛灭活RSV（FI－RSV）：在20世纪60年代的试验中接种了FI－RSV疫苗的孩子在RSV感染后出现了更严重的呼吸道疾病，甚至有两例死亡，其中年龄越小的婴儿发生的疫苗增强性疾病越重，可能是婴儿的免疫系统不成熟或者缺乏感染经验造成了疫苗增强性疾病。动物模型显示，疫苗增强性疾病主要是嗜酸性粒细胞性炎性反应。接种疫苗后，儿童的抗体活性低、免疫复合物沉积和补体活化，可能促使了病变的发生。对小鼠的研究发现，抗体质量差的原因可能是病毒蛋白质的改变和低TLR的刺激。此外，调节性T淋巴细胞应答也出现了缺陷。因此，可能是FI－RSV本身的特点和不成熟的免疫系统共同导致试验的失败。

（2）中和抗体：帕利珠单抗的显著功效表明，强中和抗体足以给下呼吸道保护性，但自然感染后产生的抗体保护性很差。在成人，血清中的IgG和鼻中的IgA效价与防止感染相关，高水平的中和抗体可以保护人们避免RSV相关的呼吸道感染，但大多数成人的抗体效价还是低于保护水平的。新生儿血清中的多数抗体是母体的IgG，研究表明，97％的婴儿从母亲体内获得RSV抗体，但这种抗体效价迅速下降。

（3）孕产妇疫苗：孕产妇接种疫苗可能是一种延缓病毒感染和防止严重疾病的有效策略，女性妊娠期接种疫苗可促进母亲和婴幼儿体内RSV抗体效价升高，且无明显不良反应。

（4）婴幼儿疫苗：一旦母体来源的抗体减弱，婴幼儿就很容易受到RSV感染，因此4月龄以上的婴儿是重要的接种对象。大多数RSV疫苗的研发集中于保护性抗体的产生，特别是集中在F蛋白上，其存在于游离病毒颗粒表面，含有独特的中和抗体识别位点。RSV感染时，新生儿可以生成抗体，但特别小的孩子不能产生抗体或抗体产生量太低。

在不存在被动获得抗体的情况下，6个月的婴儿接种麻疹疫苗产生中和抗体效价显著低于9个月以上的婴儿，这表明，新生儿免疫系统的不成熟不利于保护性免疫的形成。可能是因为隔离了抗原和降低了抗原性负载，也可能是因为掩蔽了B淋巴细胞受体表位，来自母亲的抗体提供保护的同时，也妨碍了婴儿对疫苗的反应。这可能也是新生儿不能对RSV产生有效抗体的一个原因，也是母体血清IgG和新生儿原发感染之间存在相互关系的证据。

儿童B淋巴细胞共刺激分子CD40、CD80、CD86和B淋巴细胞活化因子的受体不足、B淋巴细胞对于IL－4反应不良、γ干扰素抑制抗体应答的作用、新生儿的滤泡辅助性T淋巴细胞（Tfh）的不成熟等因素，均影响了抗体的产生。成功的RSV疫苗需要适应新生儿B淋巴细胞的特点，并提供合适的T淋巴细胞以帮助B淋巴细胞被激活。因此，诱导适当的T淋巴细胞应答将是RSV疫苗研制成功的关键。

2.儿童对RSV的细胞免疫应答

如果T淋巴细胞应答缺陷，RSV感染后会导致严重的疾病，且不平衡的T淋巴细胞应答也可引起病理反应。

（1）CD8+T淋巴细胞的应答：对病毒的清除需要CD8+T淋巴细胞应答，然而，CD8+T淋巴细胞应答也可导致疾病反应增强。有报道显示，在细支气管炎中，强大的CD8+T淋巴细胞应答是与康复相关的。另有报道，在初次RSV感染的小鼠模型中，细胞免疫应答的峰值与病理变化及病毒的清除相关，T淋巴细胞应答与支气管及肺部的炎性反应相关。有趣的是，RSV感染后的CD8+T淋巴细胞的优势应答在新生儿和成年人中是不同的，这提示不能以成年人CD8+T淋巴细胞对感染和疫苗接种的应答来预测婴幼儿。此外，CD8+T淋巴细胞反应在婴儿期设定的特定表位模式可能会持续到成年，从而对接种疫苗产生长期的影响。

（2）Th1型应答：新生儿的免疫系统缺少足够强的Th1型应答的极化信号，DC产生抑制TLR促进Th1型应答的配体，所以导致Th17和Th2型应答的出现，并产生Th2型细胞应答记忆。对新生儿脐带血单核细胞TLR的刺激，导致的IL－12和α干扰素的表达较低，但提高了Th17细胞促进IL－1，IL－6和IL－23的水平。PBMC衍生的DC，在TLR4和TLR7配体的刺激下产生Th17极化型的细胞因子。新生儿的T淋巴细胞活化环，更容易产生致病性T淋巴细胞应答，并在生命的早期对RSV设置T淋巴细胞记忆。

（3）Th2型应答：FI－RSV疫苗和G蛋白重组RSV疫苗引发了RSV再感染时更强的Th2型炎性反应。婴儿鼻灌洗液的Th1和Th2型细胞因子的比例不平衡和低γ干扰素反应与严重的RSV感染相关。此外，儿童的脐带血单核细胞产生γ干扰素的能力较差，使得呼吸道感染的概率增加。新生小鼠感染RSV导致2型炎性反应，而成年鼠则不会，生命早期RSV感染可导致Th2优势记忆。提示RSV疾病与Th2型优势应答存在相关性。

（4）Th17细胞应答：Th17细胞的反应最近也被认为与RSV疾病相关，Th17细胞在RSV感染引起的气道炎性反应和免疫应答中起重要作用。Th17细胞产生的细胞因子IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和CD161+Th17细胞在RSV感染婴儿的气管吸出物中检出升高。在成年小鼠模型中，RSV感染后，在气道中检测到IL－17、IL－6和IL－23。IL－17促进了以中性粒细胞为主的肺部炎性反应、IL－13的生成及黏液反应，并抑制了CD8+T淋巴细胞应答。

（5）调节性T细胞（Treg）：可能是产生平衡T淋巴细胞应答的关键。在小鼠模型中，它们的消耗导致Th2应答的产生和病理变化的增强。儿童细支气管炎时，Treg的水平较低，但是原因不明。在小鼠FI－RSV模型中，肺部注入趋化因子，吸引Treg，能减轻严重的肺部炎性反应，IL－10的缺乏引起RSV感染时病变增强。细支气管炎患儿气道中的IL－10与之后支气管哮喘的发生密切相关。

（6）佐剂的影响：任何RSV疫苗都需要使用适当的佐剂，以克服新生儿的Th2和Th17应答，从而产生适当的保护性T淋巴细胞记忆，以帮助产生优质抗体。在使用较低的抗原剂量或强烈的促进Th1反应的佐剂时，新生儿可以生成“成人样”的T淋巴细胞应答。

感染了RSV的肺组织样本（RSV被绿色荧光蛋白标记为绿色）

综上所述，RSV是一种在世界范围内广泛流行，可引起婴幼儿严重下呼吸道感染的病毒，并不断进化。儿童感染RSV可能会导致多种相关疾病的发生，如诱发婴幼儿喘息等。儿童的免疫系统，尤其是呼吸道的免疫功能，无论是固有免疫，还是在适应性免疫，都是不成熟的，其免疫机制与成年人并不完全相同，不能以成年人的免疫反应来推测儿童的免疫反应。母源性抗体对儿童来说非常重要，所以孕产妇接种疫苗可能是一种防治儿童感染RSV的有效策略，但是母源性抗体也有可能会影响儿童免疫系统对疫苗的反应，而一旦母源性抗体减弱，儿童的免疫系统就逐渐成熟并开始产生保护性免疫。

目前不完全了解为什么有些婴幼儿免疫保护会失败，而发生细支气管炎。一旦婴儿时期感染RSV，往往会产生不平衡的免疫应答，导致Th2型优势应答的记忆，这种优势记忆很可能会使该个体成年后患相关呼吸道疾病的可能性大大增加。所以，掌握儿童对RSV免疫反应的机制可能有助于有效疫苗的合理设计，也有利于对婴幼儿毛细支气管炎的控制，并将有利于减少成人呼吸系统疾病的发生。应用于儿童的有效RSV疫苗，需要协调好产生保护性反应与产生不恰当反应之间的关系，以避免危险的发生。彻底搞清儿童对RSV感染的免疫机制尚需不断研究探索。尤其是感染后为何只有部分儿童会出现严重疾病，治疗过程中应该采取何种方法来避免这部分严重疾病的发生，为何疫苗的接种会导致危险反应的发生，如何制备安全、有效的疫苗来预防RSV感染等方面，更需进一步研究。

资料来源：

李宏勇，韩艳娟，田新利等．儿童对呼吸道合胞病毒免疫应答的研究进展．中华传染病杂志，2016，34（11）：698-70．

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