CD30 CAR-T细胞治疗的挑战

CAR-T是经过基因工程武装化的T细胞。CD19CAR-T治疗已经在淋巴瘤治疗方面崭露头角，显示了其强大的抗肿瘤作用和不可替代性。目前已有两种CAR-T疗法赢得FDA获准上市。但是在缺少CD19表达的其它淋巴瘤治疗方面就需要其它的靶分子来代替。

对于大多数霍奇金淋巴瘤患者来说通过一线治疗可以完全治愈，但是仍有15%患者因原发性难治或者后期复发使治疗陷入僵局。一线治疗后复发患者随后治疗的标准治疗方案是高剂量药物化疗后自体移植，然而约有半数以上患者后期复发。不幸的是，这些复发患者的预后通常都很差，传统的异体移植给了这些患者最佳的缓解机会。但是这一治疗方法通常伴随高发病率和高致死率。因此，对于难治性，复发性霍奇金瘤患者来说，迫切的需要创新型的治疗方案。

ALCL(间变性大淋巴细胞瘤)是T淋巴细胞瘤的一种，具有异质性特征。ALK阳性ALCL患者预后较为乐观，5年存活率为70%-90%。而ALK阴性ALCL患者预后不容乐观，5年存活率仅为40%-60%。对化疗药物敏感的患者，拯救型疗法都是高剂量化疗药物治疗后自体移植。而复发性难治性ALCL患者预后相当差，不适合做自体移植或者二线治疗失败是挥之不去的阴影。一项回顾性研究显示，中位无进展生存期和总生存期分别为3和1.8个月。对于难治性，复发性ALCL患者来说也迫切需要替代治疗方案。

HL(霍奇金淋巴瘤)和ALCL患者的一个显著特征是细胞表面表达CD30,一个肿瘤坏死因子超家族里里的跨膜蛋白。CD30同时也表达与其它淋巴瘤，包括普遍存在于淋巴瘤样丘疹和部分DLBCL患者中，原发性纵膈B细胞淋巴瘤，真菌病，外周T淋巴细胞瘤，成年T细胞白血病/淋巴瘤。这些淋巴瘤患者迫切的需要新的治疗方法，尤其是那些初次治疗未见应答效应的患者。

CD30是一个优秀的免疫治疗靶分子，它特异性的表达于淋巴瘤细胞表面，使得针对它的治疗成为可能。CD30抗体已经被广泛的开发应用，从单一的单克隆抗体到抗体偶联药物，CD30抗体偶联药物Brentuximabvedotin (BV)已经取得了显著的治疗效果。在CD30+淋巴瘤患者治疗中大显身手，在难治性复发性HL患者治疗过程中，完全缓解率和整体缓解率分别达到了34%和75%，在难治性，复发性，系统性ALCL患者治疗过程中，完全化解率和整体缓解率分别达到了57%和86%。尽管BV治疗有很高的应答率，但是不可持续性限制了这一疗法的广泛应用，仅有22%患者表现为5年无进展生存。为了克服抗体治疗的挑战，包括药物作用持续性局限和渗透到肿瘤部位有效抗体量的局限，针对CD30CAR-T被开发了出来，BV抗体药物取得的成功使得CD30CAR-T治疗在理论上是可行的。

上世纪90年代，Hombach等人的研究第一次在体外细胞水平上证实了CD30CAR-T对HL细胞有很好的溶细胞作用。然而，当初的CAR分子由于缺乏胞内信号转到区域，细胞杀伤作用有限。Savoldo等人提出了将CAR分子装载在EBV病毒特异型性的CTL细胞表面的策略，从而确保了这一嵌合细胞有共刺激信号的作用，正如预期所料，这一嵌合细胞展示了很强的杀伤EBV病毒阳性肿瘤细胞的作用。与此同时，针对CD30的嵌合T细胞体内外实验都显示了强大的杀伤肿瘤的作用。

以下的研究解决了靶向CD30治疗理论可行性问题。首先，HL和ALCL患者体内可溶性CD30的表达量的提高并没有负向调控CD30CAR-T的作用。可能的原因是CD30CAR-T细胞上的CAR并不识别可溶性CD30的表位或者CAR-T细胞的激活多重信号刺激激活。

另一些研究探讨了致敏CAR-T细胞的所需要的CD30表达水平，CD30 CAR-T并没有清除那些由于病毒感染瞬间表达CD30的记忆性T细胞。这就预示着病毒相关抗原刺激激活记忆T细胞,其表面CD30表达水平低于肿瘤细胞表面抗原的刺激，因此不能完全激活杀伤机制。换句话来说CAR-T细胞的激活需要足够的针对CAR分子的抗原刺激，CAR-T细胞激活所需抗原分子在数量上有一个阈值。因此，对于CAR来说，抗原敏感性逐渐变为CAR分子的重要特征，肿瘤细胞与正常细胞表面抗原分子的差异化表达要求我们必须有针对性的筛选对抗原敏感的scFV分子作为CAR来应用于实体瘤治疗。CD30 CAR-T细胞定向清除高表达CD30的异体反应T细胞，调节性T细胞的潜在可能性有待进一步研究，有可能将为移植开辟新的道路。

最后一要解决的问题是CD30CAR-T对于正常细胞的毒性问题。如何做到CD30CAR-T对CD30+正常细胞耐受。研究表明CD30的确在活化的造血和造血祖细胞上有表达。这就有可能引起造血功能的紊乱或者骨髓发育不良。然而与MyLa皮肤T淋巴细胞瘤相比，CD30CAR-T针对造血祖细胞的反应非常小。与CD30-造血祖细胞想比，CD30+造血祖细胞在CD30CAR-T存在下，溶解率略高，但是与MyLa皮肤T淋巴细胞瘤相比，细胞溶解率要低得多。而且当造血祖细胞与CAR-T细胞共孵育时，有正常髓细胞克隆形成，只是红细胞克隆形成率有些许降低。更重要的是在转基因小鼠模型研究中，CD30CAR-T并未损伤T,B淋巴细胞，保持着正常的造血功能，而且未见明显的骨髓毒性。除了CD30差异化表达水平低于CD30CAR-T激活的阈值以外，造血祖细胞某些内在的特性对CD30CAR-T耐受似乎是有帮助的。造血祖细胞高表达SP6/PI-9丝氨酸蛋白激酶使得颗粒酶B失活，从而有效阻止了T细胞介导的细胞毒性。不同的细胞有不同的策略，与胚胎细胞研究一致，与肿瘤细胞相比，胚胎细胞更加耐受CD30CAR-T细胞杀伤。

截至目前，已有两项临床研究发表了研究结果，两项研究结果表明，CD30CAR-T都有良好的耐受性和抗肿瘤作用。由于两项研究中CD30CAR-T 所用CAR含有不同的scFV，不同的共刺激分子，不同的制备方案，不同的给药系统，剂量都不同，使得两项研究无法进行平行比较。

表1.已完成的CD30-CAR-T临床治疗难治性复发性CD30+淋巴瘤治疗方案

Wang等人治疗了18位难治性复发性CD30+淋巴瘤患者，（17位HL，1位ALCL）,该研究中CARscFV来自于抗体AJ878606.1，共刺激信号为4-1BB,采用了慢病毒系统。18为患者中9位接受过ASCT(自体移植)治疗，5位接受过BV治疗。患者在淋巴细胞消耗疗法包括三种组合形式的淋巴细胞消耗疗法，后接受平均剂量为1.56× 107 CAR-T cells/kg 的治疗。

18位患者中，7位部分缓解，6位病情稳定，未见完全缓解，总缓解率39%，平均无进展生存率为6个月，4为患者截至发稿时仍有反应。5例患者接受了二次CAR-T输注，2次治疗后，3例维持部分缓解，1例维持稳定，1例首次输注病情稳定患者2次治疗后为部分缓解。在大多数接受治疗患者中，外周血中CAR-T细胞输注后3-9天达到峰值，在4-8周后降低到输注前水平，同时CD30+肿瘤细胞也急剧减少，穿刺检测中很少有CD30+肿瘤细胞，这就意外着CD30CAR-T细胞对肿瘤细胞进行了有效杀伤。

Ramos等人报道了9例复发性，难治性CD30+淋巴瘤（6例HL患者，1例ALK-ALCL患者，1例ALK+ALCL患者，1例DLBCL发展为HL患者）本项实验中CD30CAR scFV来自于抗体HSR3，共刺激分子来于CD28,制备载体为逆转录病毒，9位患者中8位出现了输注后积极反应。患者中7例接受过BV治疗，6位接受过ASCT后复发。患者未做淋巴细胞清除处理，输注了高达2× 10⁸CD30 CAR-T cells/m²剂量的治疗。该治疗显示良好的耐受，未出现细胞毒性和细胞因子释放综合征的报告。

治疗后，8为患者出现了积极的疗效，2例患者完全缓解，其中1例ALK+ALCL患者进入完全缓解9个月后复发。另一位HL患者，截至发稿前，患者完全缓解已达2.5年。3位患者病情稳定，3位患者病情进展。1位接受CAR-T治疗的患者治疗前经过了自体细胞移植后进行抢救性化疗,随后出现完全缓解，再接受CAR-T治疗后，截至发稿完全缓解已达2年以上。大多数反映出现在最高剂量输注的患者身上，外周血中CAR-T剂量依赖于输注剂量，且峰值出现在输注后1周内，一周后开始逐渐下降，在6位患者中，6个月后仍能检测到CAR信号。

尽管两项研究都展示了很好的耐受性和良好的抗肿瘤作用，但是与CD19-CAR他治疗相比，疗效还是稍逊一筹。目前已有多项不同CD30CAR-T正在进行临床研究，如图表2所示

表2.临床阶段的CD30CAR-T治疗难治性，复发性CD30+淋巴瘤

如何提升CD30CAR-T的治疗效果，需要深层次的分析，多方面的解决。首先要彻底考虑淋巴细胞清除疗法。如图1CAR-T细胞输注前淋巴细胞的清除或者化疗调节都能明显的提升CD19CAR-T的持久性和有效性。淋巴耗竭化疗减轻了患者的肿瘤负荷和抑制细胞的数量。霍奇金淋巴瘤肿瘤微环境拥有数量巨大的抑制性细胞，包括调节性T细胞Treg,2型辅助性T细胞Th2,肿瘤相关巨噬细胞，这些细胞有力的维持霍奇金淋巴瘤细胞（HRS）的存活和增殖。因此，通过清除淋巴细胞，破坏肿瘤微环境中抑制细胞的作用，将有效提升CAR-T对肿瘤细胞的杀伤，最后，淋巴细胞清除释放了大量的IL-17,IL-15等细胞因子的释放，有利于CAR-T细胞的扩增。

图1.a化疗后淋巴细胞耗竭减少了抑制细胞数量如Th2,Treg,这些细胞扰乱了肿瘤微环境,化疗刺激后释放的细胞因子IL-7,Il-15可以有效促进CAR-T细胞的增殖。b.HRS细胞产生的CCL17,CCL22可以吸引Th2,Treg细胞，因为这些细胞表面表达CCR4,共表达CCR的C30CAR-T可以更有效地到达肿瘤部位。C.CD30CAR-T 细胞表面发现了PD-1的表达。免疫检查点抑制剂，CSF1R抑制剂结合CD30CAR-T治疗有望取得更好的疗效。

优化的的淋巴细胞清除策略应用于CD30CAR-T细胞治疗效果有待进一步研究。之前提到的Wang等人应用的淋巴细胞清除策略，3种化疗药物清除淋巴细胞策略未见明显的差别，目前进行的临床研究，应用氟达拉滨和环磷酰胺作为清除淋巴细胞的化疗药物，其疗效可根据CD19CAR-T临床治疗效果来推测。见图表2，（NCT02259556,
NCT02917083,NCT03049449). 另一项淋巴细胞清除方法是氟达拉滨结合盐酸苯达莫司汀见（NCT02690545）来实现。另外一种治疗策略是在自体移植后输注CD30CAR-T细胞，这种情况下，自体起到了淋巴细胞耗竭作用，导致了大量细胞因子IL-17,IL-15的释放，从而有助于CAR-T细胞的增殖和抑制性淋巴细胞的清除。目前正在进行一项CD30+淋巴瘤ASCT后输注CAR-T的巩固性治疗临床试验(NCT02663297)。

另外一个需要考虑的问题是淋巴瘤是一个局部病，淋巴瘤主要发生于淋巴组织（淋巴结，骨髓），但是CD30+肿瘤带来了新的挑战。在HL患者中，趋化因子环境影响着肿瘤细胞的聚集。HRS释放激活调节趋化因子配体CCL17,巨噬细胞趋化因子CCL22。这些趋化因子吸引表达同源受体CCR4的细胞,例如Th2,Treg,MDSC(髓衍生抑制性细胞)。这些细胞的渗透物不仅构成了HRS细胞增值的微环境，同时也构成了HRS逃避CTL杀伤的物理屏障。为了使CD30CAR-T细胞优先识别HL细胞，Savoldo等人制备了共表达CCR4的CD30CAR-T细胞。在小鼠模型中他们发现共表达CCR4的CD30CAR-T要比不表达CCR4的CD30CAR-T细胞优先到达肿瘤部位，同时有更好的抗瘤效果。但是不得不考虑的一个问题是与CCR4同族的CCL17和CCL22也表达于其它正常组织，例如皮肤，理论上共表达CCR4CD30CAR-T就增加了相应的毒性。然而由于CD30在正常组织未见表达，因此CD30CAR-T不应该造成脱靶毒性，相反共表达CCR4的CD30CAR-T由于CCR4的趋向性，应该对CD30阳性的皮肤性淋巴瘤更有效。最近，一项共表达CCR4的CD30CAR-T临床试验计划针对复发性难治性CD30+淋巴瘤的治疗着手进行中。

如上所述，淋巴瘤，HL肿瘤微环境富集着大量的抑制性细胞和分子。因此需要考虑CD30CAR协同其它免疫调节分子。候选分子中，免疫检查点抑制分子首当其冲。如图1c,在HL患者中，免疫检查点抑制分子表现出它独特性。另外Ramos等人发现在输注的CD30CAR-T细胞中，33%的细胞表达PD-1,这就意外着这些细胞很容易受到表达PD-L1肿瘤细胞的抑制。有报道称CD19CAR-T治疗后病情进展的患者结合pembrolizumab的治疗，出现了CD19CAR-T的二次扩增，和临床应答反应。然而，最佳的时间节点，有序的结合免疫检查点抑制分子与CD30CAR-T治疗非常关键，另外，结合治疗造成的毒副反应和细胞因子综合征还不得而知。随着基因工程技术的不断发展，CAR-T选择性下调抑制受体也是一个迷人的选择。

MDSC在HL患者中的肿瘤保护作用也要求探索结合一些新的调节分子来治疗，比如CSF1R抑制剂，因为MDSC细胞表达CSF1R。另外，生长因子，比如CSF1刺激肿瘤相关巨噬细胞转换为抗炎性或者M2行巨噬细胞，从而促进肿瘤细胞的增殖。HL患者体内肿瘤相关巨噬细胞数量的增加与其预后不良正相关。这进一步支持了CSF1R受体抑制剂治疗肿瘤的可行性，在HL治疗中，CSFR1抑制剂显示了良好的耐受性，但是治疗效果有限，结合CD30CAR-T治疗，或许会起到意想不到的效果。

CAR-T治疗正在成为恶性血液病治疗最有前景的疗法。CD30广泛表达于大多数淋巴瘤细胞表面，低毒性和低脱靶效应的风险使得CD30CAR-T治疗成为可能。临床前，临床研究都证明了CD30CAR-T治疗CD30+淋巴瘤的有效性，未来需要改进的策略包括淋巴细胞耗竭疗法，如何改善CAR-T迁移至肿瘤病灶，如何提高CAR-T在体内持久性以及相应的扩增，如何结合一些免疫调节抑制剂来达到更好的治疗效果。

原文来源：

Grover NS, Savoldo B.Challenges of driving CD30-directed CAR-T cells to the clinic.BMC Cancer. 2019 Mar 6;19(1):203. doi: 10.1186/s12885-019-5415-9. 

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