中国仓鼠卵巢细胞CHO已开发出了CHO-DXB11,CHO-K1, CHO-DG44, 和CHO-S等不同谱系的细胞系。尽管所有的细胞系都出自一个祖先，但是广泛的基因突变，克隆筛选使得它们之间已有了大量的异质性。测序数据显示它们有着不同的基因缺失和突变，同时也有了不同的生物进程。鲜有文章报道由于CHO细胞系基因差异造成的生物进程的不同。本文以人工染色体BAC为载体，探究了3种最常用细胞系CHO-K1,CHO-S, 和CHO-DG44在表达基因工程抗体方面的差异。通过分批培养，分批补料培养，半连续灌注培养的方式研究了细胞特异性增殖以及产物形成情况。除此之外，本文还研究了两种不同培养基对抗体表达量和糖基化的影响。我们发现，CHO细胞特异性合成抗体的能力属于不同细胞系的专有属性，宿主细胞和培养基共同决定了抗体的产量和质量。
CHO-DXB11,CHO-K1, CHO-DG44, 和CHO-S始于同一个祖先，CHO由Dr.Theodore Puck于1956年分离得到，CHO-K1作为CHO的亚克隆株诞生于1957年，1980年，CHO-DXB11由CHO-K1通过基因突变而得到，1983年Urlaub等人通过基因突变删除了DHFR双等位基因得到了CHO-DG44，1991年由CHO派生出了CHO-S,截至目前，以上四种细胞系都已用于商业化医药生产。
图1.CHO细胞系突变概览
图片来自Nat.Biotechnol. 2013, 31, 759.
2.1制备重组抗体表达细胞池及细胞适应性培养
如补充图1A、B所示初次BAC转染的CHO-K1,CHO-S, 和CHO-DG443种细胞系，对应的细胞池分泌抗体的能力分别为5.04±2.37pg//Day(CHO-K1), 3.29±1.82 pg//Day(CHO-S), 1.10 ±0.73pg//Day(CHO-DG44) ，细胞转染，筛选，亚克隆都在CDCHO培养基中完成，细胞适应性培养在ActiCHOTMP (GE Healthcare) 培养基中进行。流式细胞术检测三种细胞系构建的重组细胞株都有很好的适应性，细胞密度都能很好的达到CDCHO培养基培养的密度，甚至更高，且几乎没有抗体表达丢失的细胞。
补充图1.三种细胞系由CDCHO培养基到ActiCHOTMP培养基的适应过程。
2.2分批培养评估3种细胞系的生产性能
如图1所示分批培养期间与CHO-S,和CHO-DG44相比CHO-K1在ActiCHOTMP培养基中表现出了4-6倍的细胞密度和抗体表达量增长，因此在批量培养期间CHO-K1显示出最佳的抗体生产性能，CHO-S最差，细胞存活时间和细胞密度与细胞抗体产量关系分析显示CHO-S表现出了最快的增殖速度，CHO-K1表现出了最好的抗体表达量。
2.3批量补料培养评估3种细胞系的生产性能
在ActiCHOTMP培养基批量补料培养条件下CHO-S依然表现出了最佳的增殖速度，抗体表达方面CHO-DG44最佳达到了670mg .L-1，CHO-K1次之，达到了460mg.L-1，CHO-S370 mg .L-1。有趣的是在CDCHO培养基分批补料培养条件下CHO-K1产量为350mg.L-1，CHO-S为175mg.L-1，而CHO-DG44仅为115mg.L-1。以上实验结果表明添加营养液浓缩物显著影响着那些对所添加物骗号的宿主细胞的累计。但是无论如何CHO-K1保持了抗体的高水平表达，CHO-DG44，CHO-S次之。
对比分批培养，ActiCHOTMP培养基中CHO-K1细胞密度有个近乎2倍的峰值，但抗体的产量仅高出10%-20%，其原因归咎于抗体产生率的显著降低。补料分批培养没有影响CHO-S的细胞密度峰值，但是随着持续培养到第6天，可行的累积培养天数的延长几乎使得抗体浓度增加了6倍，在CDCHO细胞培养基中，分批补料培养CHO-S细胞其可行性细胞累积天数不及在ActiCHOTMP培养基中，因此在分批补料培养过程中，抗体表达增加仅2.5倍。对于CHO-DG44来说，分批补料培养使得细胞密度也有个近乎2倍的峰值，细胞可行性累积时间和特异性细胞抗体产生率也有提高，抗体总表达量提高了近乎5倍，但是CDCHO补料分批培养并没有改善细胞的密度和抗体表达能力。
2.4连续灌注培养评估3种细胞系的生产性能
半连续灌注培养过程中，每天换液一次，CHO-S细胞表现出最快的增殖速度，最先达到细胞密度峰值，CHO-K1以最低的细胞密度25×106 c ml-1到达稳定期，这一值与CHO-DG44在CDCHO培养基中的值类似。有趣的是CHO-DG44在ActiCHOTMP培养基中细胞持续性增值，细胞密度达到了CHO在各种培养条件下的最大值，这一结果证明了每天换液保证了CHO不同谱系细胞各自的营养需求，从而极大影响着细胞的增殖。每隔24h换液一次CHO-K1表现出最高的抗体表达量，CHO-DG44，CHO-S次之。在两种培养基中CHO-K1都表现出了最高的抗体生产率13-16pg//Day，远超CHO-DG444-5pg//Day，CHO-S2pg//Day。
图1.总细胞密度和可行性累计培养时间对应三种细胞系CHO-K1,CHO-DG44,CHO-S在三种培养条件，批量，补料批量，灌注培养，两种培养基CDCHO,ActiCHOTM培养条件下抗体表达情况。
2.5mRNA评估
高水平抗体生产率是否意味着高水平的轻重链mRNA,通过对补料分批培养细胞几天后，对抗体重链轻链mRNA定量分析，发现三种CHO细胞系，随着培养时间的累积，细胞特异性抗体生产率逐渐降低，重链，轻链mRNA也存在着相应的差异。因此我们统计了培养第4天产物特异性mRNA和细胞特异性抗体生产力qP值，所有的细胞克隆处于相同的细胞密度水平，都处于指数生长期。有趣的是CHO-K1细胞里抗体重链轻链mRNA水平与补料息息相关，相应的这种补料也影响着特异性抗体表达量。但是统计数据显示mRNA水平无法准确预测抗体表达量。
图2.平均水平（A）重链mRNA,(B)轻链mRNA,(C)灌注培养过程中三种细胞系在两种培养基里第4,7及终止培养时抗体产率。
2.6CHO细胞系和抗体生产质量
培养过程中不同CHO细胞系表现出的差异提醒我们不得不去考量所产抗体的质量。我们决定首先从补料分批培养开始研究，因为目前多数生产工艺都采取补料分批培养的策略，我们推测，由于补料批次的产品积累，即使是微小的细胞系，特别是与产品相关的差异可能比其他工艺模式更明显。
总体上来说三种细胞系表达抗体的Fc段岩藻糖糖基化主要有G0F,G1F, 和G2F三种形式，类似于自然状态下人血清中IgG的形式。研究表明细胞系和培养基影响着某些形式的糖相对丰度。比如当培养基从ActiCHOTMP转换为CDCHO培养基时，CHO-K1和CHO-S细胞中抗体半乳糖基化含量从17%提升到37%，而CHO-DG44中半乳糖糖基化抗体含量不变。表达的单抗上G0F（无乳糖酰化糖）的丰度在CHO-S组高于CHO-K1和CHO-DG44。产物甘露糖糖基化，岩藻糖糖基化，无乳糖糖基化几乎是不同CHO细胞的专有属性，培养基对其影响不大。CHO-S组表达产物甘露糖糖基化水平在2%-3%，而CHO-K1和CHO-DG44产物甘露糖糖基化水平分别为5%-9%,11%-13%。产物岩藻糖糖基化在CHO-S细胞里高达94%-96%，在CHO-K1和CHO-DG44分别为82%–84%和71%–83%。无乳糖糖型在CHO-K1细胞产物里占2%-5%，CHO-S细胞里占1%，CHO-DG44细胞产物里未见其形式的糖。
图3.三种细胞系在两种培养基里灌注培养条件下抗体重链糖型分布
除了Fc上的糖基化位点，本文还发现了表达抗体在轻链上还存在着一个糖基化位点。该糖基化位点糖型主要以岩藻糖为核心的糖复合物，以G0F,G1F,G2F形式为主，偶尔有唾液酸残基。抗体轻链甘露糖糖基化在CHO-S产物中≤1.5%，在CHO-K1中为4%–6%，CHO-DG44为5%-13%。产物轻链岩藻糖糖基化在CHO-S约为46%，CHODG44细胞中为(76–88%)，CHO-K1细胞中为83%–90%。唾液酸化抗体在CHO-K1中占21%-36%，CHO-DG44中为15%-19%，CHO-S中为6%-15%，尽管可检测的不同糖型变化在几种细胞间是微妙的，但是其对药物药效的影响需要具体问题具体分析。
图4.三种细胞系在两种培养基里灌注培养条件下抗体轻链糖型分布
哺乳动物蛋白翻译后修饰有助于蛋白正确折叠，稳定，以及功能发挥。为了探究不同细胞系所产同种抗体的构像稳定性，对蛋白质热稳定性进行研究。DSC测量发现四种过渡态蛋白未折叠形式，非常重要的是，培养基对抗体稳定性并没有影响。CHO-S表达抗体解链温度TM1为64.3±0.2℃，明显低于CHO-K1和CHO-DG44表达抗体的解链温度TM166±0.3℃ 1.7℃。进一步对表达抗体质谱分析发现，CHO-S表达抗体的轻链丢失了C末端的丝氨酸Ser。
图5.三种细胞系在两种培养基里灌注培养条件下抗体热稳定性分析
时至今日几乎70%的生物制品都来自于CHO细胞重组表达。大量文献鲜有对不同宿主细胞系进行类比。不同公司根据自己的需求选择细胞系来生产自己所需要的产品，这一点无可厚非。为了更好地阐述选择的合理性，我们对三种细胞系在两种培养基，三种培养方式下抗体表达情况做了研究，研究发现，宿主细胞的生理性偏好有利于生物质合成和抗体的表达。
3.1CHO宿主细胞到底偏好于抗体生产还是生物量合成？
为了客观地类比三种细胞系表达抗体的情况，三种细胞系最终转染表达同一种抗体的质粒，根据生产实践挑选最好的适用于生产的细胞系。在细胞系制备筛选过程中，CHO-K1都变现出了它优秀的性能。适应性培养基提供了细胞增殖，蛋白表达，遗传物质稳定等众多条件，三种细胞系在适应性培养基直接培养成功获得了生产用细胞株。细胞增殖，细胞密度在ActiCHOTMP培养基中，无论分批，补料分批，灌流培养条件下都显著高于CDCHO培养基在各种培养条件。这就表明培养基中营养物质的平衡影响着细胞株的性能。培养基独立实验中发现CHO-S显示出更高的增殖速率，高于CHO-K1,CHO-DG4410%-50%,这属于细胞株固有的生长偏好特性，在未转染的CHO-S分批培养杨条件下也显示出比CHO-K1,CHO-DG44增殖速度快的特点。
高抗体滴度和相对较低的生物量累积预示着CHO-K1有最好的抗体表达量。而CHO-S刚好相反，抗体表达量最低。CHO-DG44抗体表达量处于CHO-K1和CHO-S中间水平。这一趋势在两种培养基，三种培养条件下都是一致的。对抗体轻重链mRNA定量分析发现，不同的CHO细胞系里，尽管两种mRNA来自于同一个cDNABAC，但其拷贝数有差别，LC只有1-2个拷贝，HC有3-4个拷贝。当然，这很有可能是基础对数计算的结果。我们的数据显示，在整个过程中，与产品相关的mRNA与细胞特异性单克隆抗体的生产率之间没有统计学上显著的相关性，因为这两个参数都随着三个CHO细胞系的培养时间而变化。考虑到这些衍生的CHO细胞系经历过广泛的基因突变和克隆选择，我们推测决定抗体表达差异的关键与细胞表型和代谢有关，与特异性mRNA的差别，以及基因插入位点，细胞培养基无关。基因共表达网络（GCN）和转录量与蛋白质表达水平长期以来已有多数文章报道，但是他们之间的关系仍然存在着争议。
CHO细胞系产物合成率的差异可能要归咎于不同细胞系不等同的翻译效率及其处理加工的容量。比如最新发现的CHO-K1细胞比起CHO-DUXB11细胞有更大的内质网，更丰富的线粒体以及与之对应的高细胞特异性抗体表达量。内质网对于分泌蛋白的折叠组装非常关键，如果一个内质网里不可逆错误折叠的蛋白超过一定限度，细胞将启动未折叠蛋白响应机制，最终发生细胞凋亡。因此大内质网有利于分泌蛋白的高产率也有利于高产细胞的存活和蛋白加工。丰富的线粒体基质有利于细胞自我供能便于内质网加工处理未折叠的蛋白。由于内质网和线粒体占据了细胞内大量的空间，因此抗体表达量也反映在细胞体积大小上，我们发现灌流培养时高产的CHO-K1细胞直径15.7μm±0.7 ，CHO-DG44直径14.2μm±0.5 ，CHO-S直径13.7μm±1.1。
3.2CHO宿主细胞与抗体糖基化修饰
糖基化修饰在很大程度上决定了抗体的有效性和安全性。改变Fc段糖基化修饰将影响到Fc段的构象，受体结合，以及免疫功能效应。
我们的研究显示，抗体的糖基化主要与宿主细胞有关，较高丰度甘露糖糖基化，较低丰度岩藻糖糖基化抗体表达宿主细胞依次为CHO-DG44,CHO-K1,CHO-S。高甘露糖，低岩藻糖抗体一般有较强的ADCC效应。半乳糖糖基化可以增加抗体的功能效应，半乳糖糖基化仅受培养基的影响。然而在使用的培养基中半乳糖并没有被量化，一般情况下CHO-K1有较高的半乳糖糖基化抗体。只有抗体的轻链糖基化含有唾液酸残基，很大程度上决定了抗体立体易接近性。唾液酸化作用也有助于延长抗体的半衰期和抗炎症效应。唾液酸化抗体在CHO-K1表达的抗体中较高，CHO-DG44,CHO-S次之。宿主细胞特异性糖基化模式可能与宿主基因异质性异质性有关，不同的宿主细胞可能表达不同的糖基化基因。Lewis等人的研究发现仓鼠属有256种糖基化酶相关基因，13种非同义SNPs,2种插入或缺失移码，25%的拷贝数变异CNVs,CHO-DG44,CHO-K1,CHO-S至少存在一种以上情形。虽然不是所有的SNPs对产物糖基化和宿主基质偏好影响都能被检测到，但是糖基化是个漫长，分支进行的过程，这就增加了由于基因突变改变最终糖基化形式的可能。我们的结果也应证了这一假设，不同的CHO表达系统含有不同的糖基化模式，这样就可以根据需求选择不同的宿主生产需要的产物。
哺乳动物细胞蛋白生产过程中的翻译后修饰是蛋白质正确折叠，稳定，发挥功能的关键。蛋白质热稳定性有助于提高蛋白产量，我们的研究表明CHO-S表达蛋白热稳定性相对最差，蛋白表达量也最低，尽管蛋白表达量上CHO-DG44抗体表达量比CHO-S细胞高不太多，但蛋白稳定性确跟CHO-K1表达蛋白接近。抗体CHO-S表达抗体熔解温度Tm1相比CHO-K1,CHO-DG44表达抗体低出来的1.7℃是否影响抗体表达量还很难确认。抗体热稳定性差可能的原因是CHO-S表达抗体轻链C端ser的缺失。这一原因是否是直接导致CHO细胞系表达抗体热稳定性差还不得而知。Shen等人的研究表明删除λ轻链C端Ser有助于提高抗体的热稳定性和PH依赖的稳定性，而且删除Ser并没有影响抗体与抗原的结合。但当IgG1λ轻链的Ser存在时，热稳定性会变得更高。培养基对抗体热稳定性没有影响。
随着高通量测序的发展，大量测序数据显示，不同CHO细胞系存在着遗传物质异质性。有关遗传物质差异造成的细胞表型差异显而易见，但是在生物合成抗体表达方面具体会产生什么影响报道的并不多，本文阐述了细胞表型决定了CHO细胞特异性偏好表达抗体和生物合成过程。CHO-K1代谢偏好于抗体形成，CHO-S代谢偏好于生物量形成，CHO-DG44介于之间。这种偏好独立与培养模式和培养基。因此生产过程中细胞系的选择对产物有根本性的影响。当下CHO细胞系基因组和表型差异还不太清楚，目前还未成为宿主选择考虑的对象。CHO序列特异性知识与特异性培养方法的结合，将为未来构建细胞系工程方法和细胞系后续工艺，以及生物过程和细胞培养基的改进提供有力的工具。本研究发现基因背景影响着宿主细胞的表型，最终影响着产物的产量和糖基化修饰等质量。因此正确的选择宿主细胞才能达到生产所需求产物的目的。
原文来源：Reinhart D, Damjanovic L, Kaisermayer C,et,al. Bioprocessing of Recombinant CHO-K1, CHO-DG44, and CHO-S: CHO Expression Hosts FavorEither mAb Production or Biomass Synthesis.Biotechnol J. 2019 Mar;14(3):e1700686.
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