Plos Biology：基于甲型肝炎病毒抗原表位结构的靶向药物筛选

近日，中国科学院生物物理研究所研究员王祥喜、中科院院士饶子和和四川大学教授苏丹合作，在国际期刊 Plos Biology 杂志上在线发表了题为Structural basis for neutralization of hepatitis A virus informs a rational design of highly potent inhibitors的论文，研究解析了甲型肝炎病毒与多株中和性抗体复合物三维结构，发现了甲型肝炎病毒独特的保守抗原表位并利用该表位的结构进行靶向筛选药物化合物库和活性验证，最后发现一种用于头颈部癌症治疗药物可以作为治疗甲型肝炎病毒感染药物开发的先导化合物。由结构到靶向药物筛选的策略对于发现针对其他人类重大疾病相关病毒的药物开发具有重要的借鉴意义。

甲型病毒性肝炎（Type A viral hepatitis），是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus, HAV）引起的一种传染病，感染HAV后可引起不同程度的急性症状。现今全球每年仍有150万甲型肝炎病毒的感染病例。甲型肝炎作为一种传染病，其流行、爆发与该地区的收入状况、卫生和生活条件密切相关。目前，甲型肝炎持续威胁着卫生和生活条件差的一些地区。然而最近大量研究发现，发达国家由于许多成年人缺乏天然或疫苗诱导的获得性甲型肝炎免疫，导致甲型肝炎在这些地区大量爆发，开始成为一种新的公共卫生问题。

尽管HAV疫苗是预防甲型肝炎的最有效的方式，但目前全世界范围内仅有16个国家和地区将甲肝疫苗纳入常规免疫接种范围，所以全世界范围内甲型肝炎感染的负担仍然很重。对于甲型肝炎的治疗，尤其是针对大规模的突发性感染，到目前为止还未有特异性治疗药物上市，所以对于相关药物研制尤为迫切。

1、4株高中和活性HAV小鼠单克隆抗体的筛选

中和性抗体与病毒复合物精细三维结构的研究是确定其精确结合位点最直接、高效的技术手段，对于揭示机体免疫抑制机制及抗病毒药物的研发起到至关重要的作用。基于此，相关研究人员筛选得到4株新的高中和活性的抗体F4、F6、F7和F9，其对HAV的50%中和活性可达0.1~0.85nM范围。进一步的研究发现，这4株中和性抗体和之前分离得到的R10中和性抗体一样能高效地抑制病毒与宿主细胞的结合（图1）。

Fig 1. Characterization of F4, F6, F7, F9, and R10 mAbs. 

2、HAV与单抗复合物的电镜结构H及特殊相互作用

研究人员采用低温冷冻电镜单颗粒重构技术解析了4株中和性抗体与HAV复合物的高分辨率三维结构。通过对复合物结构比较，发现这几株中和性抗体均围绕在五次轴周围，结合在衣壳蛋白五聚体边缘，位于二次轴和三次轴之间，横跨两个五聚体，识别HAV衣壳蛋白上由VP3和VP2的共同组成的空间构象型表位（图2，图3）。

Fig 2. HAV与4株单抗的复合物结构

Fig 3. Typical interaction between HAV with F6 Fab.

3、HAV单一独特表位的发现与药物筛选

结合F4，F6，F7和F9结合的HAV的高分辨率低温电子显微镜（cryo-EM）结构以及之前对抗原结合-HAV复合物的R10片段的研究结果，研究进一步揭示了由5种中和单克隆抗体识别的表位的位置和性质。研究发现，这些单抗识别结合的抗原表位在人源的6种HAV基因型中都极其保守（图4），抗原表位的大部分氨基酸分布在一个“沟壑”两旁，该区域在前期研究中被证实正是受体结合的潜在位点，这些特性都表明该区域是个理想的小分子抑制剂结合靶点（图5）。

针对这个靶点，研究人员在单克隆抗体的重链中选择了对衣壳蛋白结合有重要贡献的四个氨基酸残基作为药效团进行建模，并利用这一药效团模型在DrugBank库中进行了大规模的计算机模拟药物筛选。通过体外抑制实验，从DrugBank库中筛选到一个抑制效果最佳的先导药物——golvatinib (IC50约为1uM)（图6）。功能实验证明，golvatinib分子并不引起HAV颗粒稳定性改变，而是通过阻断HAV与细胞表面受体的结合进而起到抑制HAV感染的作用，研究者最后根据分子对接的结构从原子水平分析了其抑制机理，为进一步改造这一先导化合物提供了理论依据。

Fig 4. Analysis of the conservation and structure activity correlates of F4, F6, F7, F9, and R10 Fab. 

Fig 5. The single, conserved antigenic site on the surface of HAV.

Fig 6. In silico–designed anti-HAV drug candidates. 

Plos Biology杂志特邀新西兰奥塔哥大学电子显微镜中心主任MihneaBostina就本文针对该研究领域撰写综述。同时也在网站首页进行了新闻宣传报道。这是饶子和/王祥喜联合研究团队继解析甲型肝炎病毒精细三维结构(Wang X, et.al Nature 2015）、揭示甲型肝炎病毒中和性抗体R10“受体模拟”的中和机制(Wang X, et.al PNAS 2017）后又一重要研究成果，也是由结构到靶向药物筛选的研究典范。研究人员基于全病毒颗粒抗原表位结构进行药物设计与筛选的这一策略，对于发现针对其他人类重大疾病相关病毒的药物开发是十分值得借鉴的。

本研究得到中科院先导专项、中科院重点部署项目、科技部“973”项目、国家自然科学基金等资助。曹磊、刘岯和杨盼为该文的共同第一作者，王祥喜、饶子和和苏丹同为该文的通讯作者。

ABSTRACT

Hepatitis A virus (HAV), an enigmatic and ancient pathogen, is a major causative agent of acute viral hepatitis worldwide. Although there are effective vaccines, antivirals against HAV infection arestill required, especially during fulminant hepatitis outbreaks. A morein-depth understanding of the antigenic characteristics of HAV and the mechanisms of neutralization could aid in the development of rationally designed antiviral drugs targeting HAV. In this paper, 4 new antibodies—F4, F6,F7, and F9—are reported that potently neutralize HAV at 50% neutralizing concentration values (neut50) ranging from 0.1 nM to 0.85 nM. High-resolution cryo-electron microscopy (cryo-EM) structures of HAV bound to F4, F6, F7, andF9, together with results of our previous studies on R10 fragment of antigen binding (Fab)-HAV complex, shed light on the locations and nature of the epitopes recognized by the 5 neutralizing monoclonal antibodies (NAbs). All the epitopes locate within the same patch and are highly conserved. The key structure-activity correlates based on the antigenic sites have been established. Based on the structural data of the single conserved antigenic site and key structure-activity correlates, one promising drug candidate named golvatinib was identified by in silico docking studies. -based antiviral assays confirmed that golvatinib is capable of blocking HAV infection effectively with a 50% inhibitory concentration (IC50) of approximately 1 μM. These results suggest that the single conserved antigenic site from complete HAV capsid is a good antiviral target and that golvatinib could function as alead compound for anti-HAV drug development.

原文链接：

1.Lei Cao ,Pi Liu ,Pan Yang ,Qiang Gao,Hong Li,YaoSun,Ling Zhu,Jianping Lin,Dan Su ,Zihe Rao, Xiangxi Wang. Structural basis forneutralization of hepatitis A virus informs a rational design of highly potent inhibitors. PLoS Biol. 2019 Apr30;17(4):e3000229.

doi: 10.1371/journal.pbio.3000229. eCollection 2019Apr.

2.中科院生物物理研究所:生物物理所等发现治疗甲型肝炎先导化合物

http://www.cas.cn/syky/201905/t20190505_4690787.shtml

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