ctDNA检测的秘密武器—Duplex UMI-ctDNA测序技术

同一癌种的不同患者，同一个肿瘤患者的不同治疗阶段、同一肿瘤组织的不同区域，肿瘤的生物学特征均存在一定的差异。液体活检既可以克服组织检测的异质性，又具有简便、安全、无创、实时等特点，尤其是对于无法进行手术或穿刺，又或者肿瘤位置导致取样困难的患者而言，液体活检是一项可以弥补组织检测局限性的方法，近年来在肿瘤靶向治疗、耐药监测的实时评估等方面发挥着重要的作用。

目前液体活检的靶标包括：游离的循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤RNA（ctRNA）和外泌体（携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等）。

ctDNA是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA（cfDNA），在血液中的半衰期短，可以实时反映肿瘤的动态变化。

肿瘤患者体内的肿瘤细胞数量远远低于正常细胞，cfDNA在血浆中的含量很低，而ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌种，不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大，因此相比于组织检测，ctDNA的检测需要更高的灵敏度和特异性。

目前用于ctDNA液体活检的技术主要有ARMS-PCR、数字PCR（ddPCR）和第二代测序（NGS）。

NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是应用最广泛的的基因检测技术。但由于NGS的实验流程技术较为复杂，在文库构建、目标区域捕获及测序过程中不可避免的会引入一些扩增和测序的错误，这些错误我们把它们叫做背景噪音，而ctDNA检测往往突变频率较低，受到背景噪音干扰较大，来自ctDNA样本中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成假阴性或假阳性结果，这就限制了ctDNA检测的灵敏度和特异性。

那就不得不提到一项颇具前景的技术—分子条形码技术

分子条形码又称分子标签（Unique Molecular indentifier，UMI），它的原理就是给每一条原始DNA片段加上一段特有的标签序列，经文库构建及PCR扩增后一起进行测序。这样，根据不同的标签序列我们就可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正的携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。

①　2012年5月，Tim Forshew等人率先开发了基于分子标签的TAm-Seq方法。

②　2012年9月，Michael W. Schmitt等利用双链分子标签技术将错误率显著降低。它的技术原理如下：

如图中所示，α和β均是连接到DNA模板上的随机DNA序列，不同的模板连接的序列不同，即为ctDNA加上了独特的标记。经PCR扩增后通过α和β的序列就可以识别出同一模板来源的片段，再根据α和β互补识别同一模板的正反链。

①　i图中一个错误仅影响了扩增出的少数序列，统一分析同一模板来源的片段可以将这个错误过滤；

②　ii图中出现的错误影响了所有正链序列，但反链正常，根据碱基互补原则，可将此种错误校正；

③　iii图中则显示了排除了一些引入错误和系统错误后得到真正的突变。

2015年8月，Peng等人的研究中利用分子条形码与不用分子条形码的实验进行对比，通过对实验数据的分析发现通过引入分子条形码技术，大大降低了低频突变的假阳性率。

2016年5月，斯坦福大学医学院的研究人员基于其曾开发的ctDNA定量检测方法Capp-Seq法，又引入了分子条形码策略和集成数字错误抑制方法（iDES），使测序灵敏度有了很大的提高。

研究人员发现，两种技术结合使用使错误率下降了15倍。通过这种方法来监控30名NSCLC患者中的突变，对EGFR激酶域突变的敏感度达到92%，特异性达96%，并能够检测到频率低至0.004%的突变。

通过以上这些研究报道可以看出，分子标签技术使得NGS技术的灵敏度和特异性都得到了很大的提高，这为其在肿瘤早期诊断、用药方面的指导以及耐药机制分析等方面的应用创造出越来越大的优势。

晶泰通过不断优化，基于双链分子标签的原理，开发出Duplex UMI-ctDNA测序技术。