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9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 (修订 )
1143 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供 试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和 显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有 争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU 与 1 个内毒素国际单位（IU） 相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲 裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号 B 和 C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可 靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于 干扰试验及检查法中编号 B 和 C 溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、 光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝胶法）或小于 0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素 试验无干扰作用。
鲎试剂是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反 应。除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应，产生假阳性结果。如遇含有 β-葡聚糖的样品，应使用去 G 因子鲎试剂或 G 因子反应抑制剂来排除鲎试剂与 β-葡聚糖的反应。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用 干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素 检查的适宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应 选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成 供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的 pH 值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值在 6.0～8.0 的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱 溶液或缓冲液调节 pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素 的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定
药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公 式确定：
L=K/M
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U（活性单位） 表示；
K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU/（kg·h）表示， 注射剂 K=5EU/（kg·h），放射性药品注射剂 K=2.5EU/（kg·h），鞘内 用注射剂 K=0.2EU/（kg·h）；
M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml/（kg·h）、mg/（kg·h） 或 U/（kg·h）表示，人均体重按 60kg 计算，人体表面积按 1.62m2 计 算。注射时间若不足 1 小时，按 1 小时计算。供试品每平方米体表面积 剂量乘以 0.027 即可转换为每千克体重剂量（M）。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做 必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数（MVD）
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶 液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内 毒素限值的检测。用以下公式来确定 MVD：
MVD=cL/λ
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值；
c 为供试品溶液的浓度，当 L 以 EU/mg 或 EU/U 表示时，c 的单位需为 mg/ml 或 U/ml，当 L 以 EU/ml 表示时，则 c 等于 1.0ml/ml。如需计算在 MVD 时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式 c=λ/L；
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使 用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法 1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验
在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内 毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用 EU/ml 表示。当使用新批号的鲎试 剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核 试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素 工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀 15 分钟，然后制 成 2λ、λ、0.5λ和 0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋 涡混合器上混匀 30 秒。取不同浓度的内毒素标准溶液， 分别与等体积（如 0.1ml）的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度平行做 4 管；另外取 2 管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。另外 2 管加入 0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口， 垂直放入 37℃±1℃的恒温器中，保温 60 分钟±2 分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转 180°，若管内形成凝胶，并且凝胶 不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管 壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。
当最大浓度 2λ管均为阳性，最低浓度 0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴 性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度 的测定值（λc）。
λc=antilg（∑X/n）
式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素 浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；
n 为每个浓度的平行管数。
当λc 在 0.5λ～2λ（包括 0.5λ和 2λ）时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验
按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D，使用的供试品溶液应为未检验出 内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
注：A 为供试品溶液；B 为干扰试验系列；
C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D 为阴性对照。
只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液 B 的结果 符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情 况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于 MVD 的稀释倍数 下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀释，再重复干扰试 验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、 透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不 会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进 行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查 法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影 响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
（1）凝胶限度试验
按表 2 制备溶液 A、B、C 和 D。使用稀释倍数不超过 MVD 并且已经排除干 扰的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 表 2 凝胶限度试验溶液的制备
表 2 凝胶限度试验溶液的制备
注：A 为供试品溶液；B 为供试品阳性对照；C 为阳性对照；D 为阴性对照。
结果判断
保温 60 分钟±2 分钟后观察结果。若阴性对照溶液 D 的平行管 均为阴性，供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液 C 的平行管 均为阳性，试验有效。
若溶液 A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液 A 的两个平 行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液 A 的两个平行管中的一管为阳性， 另一管为阴性，需进行复试，复试时溶液 A 需做 4 支平行管，若所有平行管均为 阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。
若供试品的稀释倍数小于 MVD 而溶液 A 结果出现不符合规定时，需将供试品 稀释至 MVD 重新实验，再对结果进行判断。
（2）凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表 3 制备 溶液 A、B、C 和 D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断
若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液 B 的平行管均为阳性，系列溶液 C 的反应终点浓度的几何平均值在 0.5λ～2λ之 间，试验有效。
系列溶液 A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终 点浓度。如果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试 验的初始稀释倍数，即得到每一系列内毒素浓度 c。
若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定。每一系列 内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[ 按公式 cE=antilg（∑lgc/2）]。若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于 λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的 初始稀释倍数）。
若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，则判定供试品不符合规定。当 供试品溶液的所有平行管均为阳性，可记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释 倍数乘以λ。
注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释 至 1 倍、2 倍、4 倍和 8 倍，最后的稀释倍数不得超过 MVD。 B 为含 2λ浓度标准内毒素的溶液 A（供试品阳性对照）。 C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。 D 为阴性对照。
方法 2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据 反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存 在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到 达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的 方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底 物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色 法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时 释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法 是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应 时间，或检测色度增长速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为 37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所 用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供 试品的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会 影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素制成溶液，制成至少 3 个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数 不得大于 10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混 匀时间同凝胶法，每一浓度至少做 3 支平行管。同时要求做 2 支阴性对照。当阴 性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲 线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于 0.980， 试验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm)，作 为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表 4 制备溶液 A、B、C 和 D。
注：A 为稀释倍数不超过 MVD 的供试品溶液。
B 为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液 A 有相同稀释倍数的供试品 溶液。
C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D 为阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液 的内毒素含量 Ct 和 Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。
R=（Cs-Ct）/λm×100%
当内毒素的回收率在 50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去 除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。
检查法
按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效：
（1）系列溶液 C 的结果要符合 “标准曲线的可靠性试验”中的要求；
（2）用溶液 B 中的内毒素浓度减去溶液 A 中的内毒素浓度后，计算出的内毒 素的回收率要在 50%～200%的范围内；
（3）阴性对照吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。
结果判断
若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小 于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值， 判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。