干货|下游纯化工艺平台方法的比较

本篇文章主要介绍了关于抗体下游纯化工艺开发的平台方法。一个好的平台是由一个个定义良好的操作单元模块组成，而大部分的操作单元都是预先定义好的，我们需要开发的只是每个操作单元中的关键元素。

关键因素的考量是衡量一个工艺好坏的重要指标。首先，我们需考虑的因素是纯度（例如：HCP，残余DNA，残余Protein A，细菌内毒素等）和杂质（例如：高聚物，低聚物等）。其次，整个工序中，除病毒的能力是确保产品安全性的重要保障。再次，我们还需要考虑过程开发的速度，即一个产品从研发到进入临床所需的时间。同时，工艺还必须满足一些标准准则，包括收率、产量、稳健性、可靠性、稳定性等。因此，一个灵活的、通用的mAbs平台方法的建立尤其重要，一方面可以大大缩短时间成本，一方面可以生产出高纯度、高质量、安全有保障的产品。

下面，我们从一张流程图（Fig. 1和Fig. 2）来简单介绍和比较一下Amgen和Genentech发表的下游工艺平台方法（数据主要来源于参考文献所列四篇文献）。

Fig. 1 Platform downstream process of mAbs of Amgen

Fig. 2 Platform downstream process of mAbs of Genentech

根据Fig.1 和Fig.2 我们不难看出，Amgen和Genentech的下游纯化平台方法的框架基本上是一致的。第一步，细胞收获液的澄清处理；第二步，初纯——亲和层析；第三步，病毒灭活；第四步，精纯——阴阳离子层析；第五步，除病毒过滤；(这里需注意的是Genentech将除病毒过滤工序放在了阴阳离子两步层析中间。笔者认为顺序的不同对样品纯度的影响不是很大，工序的先后可能只是为了方便操作。)第六步，超滤透析。这6步即可看作是5个预先定义好的操作单元，每一个抗体之间既有相似性又具有其自身的特异性，所以这就需要我们在这些预定义好的操作单元里探究并确定一些关键因素，为每一个单抗分子都量身定做一个最佳“居住地”，这也就意味着一个好的平台方法必须在具有一定通用性的同时也具备较好的灵活性。

下面我们将继续去探究Amgen和Genentech他们在每一个操作模块中都探究了哪些关键因素及每一个模块存在的意义是什么。

第一步，细胞收获液的澄清。主要是离心、深层过滤。深层过滤器主要采用的是一种多孔介质，从而可以去除一些细胞碎片和HCP。深层过滤器通常不会有绝对的孔隙大小评定，所以通常我们会在其后面接一个0.45μm或0.2μm的过滤器来去除一些固体微粒。这一步操作几乎适用于所有的mAbs。

第二步，初纯——亲和层析。亲和层析主要用于捕获抗体，使金黄色葡萄球菌A蛋白在pH为中性或碱性条件下与IgG分子的Fc段特异性结合，在pH为酸性条件下可以解离被洗脱下来。该步骤可以使样品纯度达到99%，还可以去除90%以上的HCP和DNA，优化较好的工艺还可以去除6log以上的病毒和少量聚体。但该步骤不能去除Fc片段、大量的聚体和脱落的Protein A。Amgen和Genentech在亲和层析这一步所探究的的相关操作参数如Table 1和Table 2所示。

Table 1 The Operational parameters for Protein A chromatography of Amgen

Table 2 The Operational parameters for Protein A chromatography of Genentech

   第三步，病毒灭活。FDA的Q5A指导文件37要求必须使用两种专门用于病毒减少的方法做正交实验证明哺乳动物细胞培养产物的安全性。低pH孵育（pH<3.8）已经被证明是一种有效病毒灭活的方法。Genentech在低pH灭活这一步中主要考虑到以下主要参数：pH、孵育时间、孵育温度、调酸buffer、蛋白浓度、含盐（NaCl）量、蛋白等电点等。

第四步，精纯——CEX、AEX。CEX采用的是结合模式，蛋白在pH<pI条件下带正电，与阳离子交换剂结合，最后用一定盐梯度将目的蛋白洗脱下来，其主要去除聚体、抗体片段、残留Protein A、部分HCP。AEX采用的是流穿模式，蛋白在pH<pI条件下带正电，与阴离子交换剂不结合，直接流穿；而大部分HCP的pI< pH，带负电，与阴离子交换剂结合；在此条件下残余DNA、细菌内毒素也能结合在柱子上；因此，AEX主要去除残留DNA、HCP和病毒（>4log）。Amgen认为，精纯色谱法的选择取决于需要清除的杂质性质。根据杂质的性质选择正确的色谱方法（见Fig. 3），会达到事半功倍的效果。Genentech在采用CEX主要考虑的参数如Table 3所示；采用AEX主要研究了结合和流穿两个模式，其流穿模式的条件为pH低于pI 0.5-1个单位，电导<7.5 ms/cm；相关实验数据表明：电导越低，HCP清除率越高；而pH越高，电导越高，都会使蛋白趋向于结合柱子；1M NaCl通常用于阳柱的重生。

Fig. 3 Modes of chromatography employed for clearing specific kinds if contaminants

Table 3 The Operational parameters for CEX of Genentech

   第五步，除病毒过滤。该步骤通常是用来证明病毒有效去除的第二个方法。病毒过滤器根据其孔隙大小分为逆转录病毒（<50nm）以及细小病毒（<20nm）级过滤器。根据蛋白量，选择合适的滤器，在恒压模式下操作。

第六步，超滤透析。通过该步骤是将样品置换到最终的制剂Buffer中，最终形成原液以便冻存或制成最终的成品。该步骤主要会考虑到的参数有超滤膜包的类型、跨膜压力、透析倍数、样品浓度等。

以上即是关于Amgen和Genentech下游纯化工艺的一个平台方法的全部分享。一个好的平台方法的建立必须在保证产品安全性、有效性的前提下，具备一定的通用性、灵活性、简单性、廉价性等。在此基础上，我们才能真正做到做好每一个抗体。

参考文献

1.Abhinav A. Shukla , Brian Hubbard, Tim Tressel, Sam Guhan, Duncan Low. Downstream processing of monoclonal antibodies—Applicationof platform approaches. Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28–39

2.Benedicte Lebreton, Gregory S. Blank, Stefanie Sze-Khoo. Purification Strategies to Process 5 g/L Titers of Monoclonal Antibodies. BioPharm International Volume 2009 Supplement, Issue 2.

3.Robert L. Fahrner , Heather L. Knudsen , Carol D.Basey. Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18(2001) 301.

4.Yuan Xu. Bracketed Generic Inactivation of rodent Retroviruses by Low pH treatment for Monoclonal Antibodies and Recombinant Proteins. Biotechnology and Bioengineering, 2003,82(3)，321-329.

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