生物等效性研究（Bioequivalence，BE）是评价同一药物不同制剂间差异及仿制药与原研制剂间可替换性的重要方法。近年来，我国生物等效性研究质量得到了很大程度的提升，但近期提交的申报资料中陆续出现不合理剔除“离群值”等的问题，如何对这些新问题做出科学合理的评价是我们审评当前阶段面临的新的挑战。
一、离群值的判定
生物等效性研究中，离群值通常为一个或多个血药浓度测定值或药代动力学（Pharmacokinetics，PK）参数与研究中其他受试者相应结果明显不一致的数据。
如在血药浓度检测过程中有时会出现一个或多个浓度点远远高于或低于前后浓度点的情况，即通常所说的“跳点”。
PK参数异常主要表现为一个或多个受试者服用某一制剂（受试制剂或参比制剂）后的药时曲线下面积（Area under the curve，AUC）或最大血药浓度（Cmax）与另一周期或其他受试者的结果相比差异较大。
离群值的出现可能是制剂质量不均一、试验过程中出现方案偏离或样本检测时的操作失误等原因造成的。但是，由于离群值是在样本检测完成、甚至是统计分析完成后发现的，也可能存在研究者主观判定因素。
二、出现离群值的原因
1. 制剂质量问题
试验所用制剂可能存在批内或批间均一性差的情况，例如，受试者服用某种缓释制剂而产生不寻常的高或者低的响应，这种离群值的出现可能是由于缓释制剂质量不均一，导致在某个或某些受试者出现剂量突释或由于包被因素阻止药物的溶解而产生制剂释放异常。
2. 方案偏离导致的离群值
由于试验过程中受试者有意吐药等行为，可能导致受试者未服药或服药剂量偏低，或服药后由于制剂本身存在的不良反应发生呕吐或严重腹泻，导致药物暴露量减少，从而产生离群值。
检测时由于个别样本处理或分析检测过程中发生方案偏离或出现失误，导致待测物最终检测结果不准确，也可能产生离群值。
3. 受试者与制剂相互作用
可能在少数个体中由于受试者和制剂的相互作用，导致这些个体对两种制剂的相对生物利用度与多数群体相比明显不同，尽管这两种制剂可能在大多数个体中是生物等效的，但对于这些少数个体来说，这两种制剂并不显示生物等效性[1]。
三、对离群值的一般考虑
1. 基本考虑
虽然目前用于判定离群值的统计学方法有很多，但是即使在统计学验证的基础上，也不能简单地认为某个结果被判定为离群值就可以直接剔除。因为不合理剔除离群值可能会导致原来不等效的结果变成等效，从而使研究结论为生物等效的制剂存在潜在不等效风险。
我国发布的《生物样品定量分析方法验证指导原则》[2]严格规定，对于生物等效性研究，通常不能接受由于药动学理由重新分析试验样品。同样地，FDA《生物等效性统计学指导原则》中要求[1]，在制剂失败的情况下，受试制剂或参比制剂都有可能会出现离群值。但是，就亚群而言，即使在参比制剂上观察到不寻常的响应，仍然可能会担心两种制剂缺乏可替换性。特别是对于非重复设计试验，通常不建议基于上述原因剔除离群值。使用重复的交叉设计，设计的重新测试特征应该能对是否删除离群值起到指示作用。
若认为某个数据点为离群值，其原因应该具有统计上的说服力，并且如果可能的话，应在方案中预先规定。
EMA《关于生物等效性研究的指导原则》[3]中要求，仅仅基于统计学分析和药代动力学原因剔除数据是不被允许的，因为不可能将制剂效应与其他影响药代动力学的影响因素区分开来。
2. 特殊情况
离群值可能是由于意外事件，如技术缺陷引起的，如发生此类特殊情况，申请人应该提供足够的科学证据来证明。EMA《关于生物等效性研究的指导原则》[3]中对于几种特殊情况的处理方式作了较为具体的规定。
（1）服用参比制剂的受试者缺乏任何可测浓度或只有非常低的血浆浓度。如果AUC小于参比制剂AUC几何均值的5％（应排除离群值受试者的数据），则认为受试者具有非常低的血浆浓度。基于此原因排除数据只会在特殊情况下被接受，并且审评可能对试验的有效性提出质疑。
（2）受试者的基线浓度非零且> 5％ Cmax，这些数据应从生物等效性计算中剔除。
EMA一份关于氨氯地平/缬沙坦的审评报告中[4]，监管机构接受了由于上述第一种情况而剔除受试者的研究结果。
3. 再给药研究
某些情况下，申请人怀疑受试者服药时出现方案偏离，希望通过对存在离群值的受试者重新给药，并重新进行血样采集和血药浓度检测，以证实剔除离群值的合理性。FDA认为，如果再给药研究包括可疑受试者和一定比例的来自首次BE研究的受试者作为对照，且受试者的例数应能使再给药研究具有一定的把握度，则可以通过再给药的方式来证明特殊原因引起的离群值。若可疑受试者在再给药研究中显示正常响应，则可以证实在首次BE研究中响应确实异常，并接受从原BE研究中剔除离群值。
EMA对再给药研究则有不同的认识。在OVERVIEW OF COMMENTS RECEIVED ON DRAFT GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE[5]中显示，某些情况下，经药代动力学分析后会发现一些响应异常的血浆样本，即使在整个临床试验中并没有报道过任何的事件，也会存在受试者未吞咽药品的可能。在这种情况下，应该可以进行重新给药研究，以证明初始研究的离群值，并根据重新给药研究的结果从评价中剔除该受试者。但对于以上建议，EMA最终得出的结论为：目前暂不支持再给药研究，因为某个结果在重新给药时未重现并不意味着这个结果是不真实的。EMA并不期望每次都会有同样的结果。任何侧重于将具有较大差异的结果作为排斥目标的方法都会增加错误地显示等效性的可能[5]。这与我国指导原则中通常不能接受由于药动学理由重新分析试验样品的规定是一致的。
四、不合理剔除现象举例
审评过程中发现，目前申报资料中存在一些不合理剔除数据的现象，以某种不恰当的理由剔除主观上认为不合理的数据，从而达到试验结果符合生物等效性标准的目的。
如：某BE研究报告中受试制剂和参比制剂 Cmax几何均值之比的90%置信区间为96.2%~124.3%，但研究以某受试者试验过程中（药后4小时）出现低血糖服用了巧克力为由，剔除了该例受试者（Tmax为3小时）的全部数据，将该受试者数据重新纳入生物等效性统计分析，结果显示，两制剂Cmax几何均值之比的90%置信区间为99.7%~126.7%，显然两制剂存在不等效风险。
另一BE研究报告中以某受试者试验结束后尿液红细胞一个“+”为由，未将该受试者数据纳入BE分析集，AUC和 Cmax均符合生物等效标准。但审评发现，该受试者筛选期就出现了尿液红细胞一个“+”，却未将其剔除，该受试者完成了全部试验。将该受试者数据重新纳入并进行生物等效性分析，结果显示，受试制剂和参比制剂AUC几何均值之比的90%置信区间为76.4%~114.1%，因此审评不能接受两制剂生物等效的结论。
五、结语
对于生物等效性研究中的离群值应当非常谨慎，如果制剂可能本身并不等效，不排除存在申请人主观地选择和排除潜在离群值从而改变生物等效性结论的可能。
通常情况下，生物等效性研究中不建议剔除离群值。对某些特殊情况下可能真实存在的离群值予以认可，并不意味着可以随意基于药动学原因剔除数据。不合理剔除离群值，使原本不等效的制剂得出相反的结论，可能给公众用药安全带来极大风险。
申请人应在开展生物等效性研究前进行充分的制剂研究，确保制剂质量均一、可控，试验过程中应严格控制试验质量，把控好每一个细节，尽量避免试验偏离，才能在根本上避免离群值的出现，确保试验数据的可靠性。
参考文献:
[1] Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence. https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm070244.pdf. January 2001.
[2] 《9012 生物样品定量分析方法验证指导原则》. 中国药典2015年版. 363-368.
[3] GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/01/WC500070039.pdf. 01/08/2010.
[4] Assessment report Amlodipine/Valsartan Mylan. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Public_assessment_report/human/004037/WC500204384.pdf. 28 January 2016.
[5] OVERVIEW OF COMMENTS RECEIVED ON DRAFT GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE CPMP/EWP/QWP/1401/98 REV. 1. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Other/2010/02/WC500073572.pdf. 10/02/2010
（统计与临床药理学部供稿）
始发于微信公众号： 中国药审