仿制药生物等效性试验样本量估算探讨——培优BE系列26

［摘要］随着我国仿制药质量与疗效一致性评价的全面开展，平均生物等效性研究作为一致性评价的重点内容将迎来高峰，对于平均生物等效性研究如何确定合适的样本量(即受试者的数量)既是关键又是难点。本文综述了国内外对平均生物等效性研究样本量的法规要求，探讨了平均生物等效性试验样本量的影响因素、估算方法、预试验的作用等问题，以期能够对平均生物等效性研究样本量的确定提供建议。

［关键词］一致性评价;平均生物等效性;药动学;样本量;仿制药

　　为提升我国制药行业整体水平，保障药品安全性和有效性，促进医药产业升级和结构调整，增强国际竞争能力，2016年2月国务院印发《“十三五”国家药品安全规划》［1］，提出要进一步提高药品质量，批准上市的仿制药要与原研药质量和疗效一致。2016年3月5日国办发〔2016〕8号文件《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》［2］(以下简称“《意见》”)，《意见》要求，化学药品新注册分类实施前批准上市的仿制药，凡未按照与原研药品质量和疗效一致原则审批的，均须开展一致性评价。国家基本药物目录(2012年版)中2007年10月1日前批准上市的化学药品仿制药口服固体制剂，应在2018年底前完成一致性评价，其他仿制药在首家通过一致性评价后3年内不通过评价的，注销文号。国务院和国家食品药品监督管理总局(CFDA)高度重视一致性评价，为推进一致性评价出台了一系列政策性文件和多个指导原则。对于仿制药一致性评价，主要包括质量一致和疗效一致，质量一致性是指药学一致性，包括关键质量参数(CQAs)的一致和质量标准的相当;对于疗效一致的评价方法原则上应该通过生物等效性试验(BE)评价，为促进和规范生物等效性研究，2016年3月28日CFDA发布了《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》［3］，2017年2月17日和28日CFDA分别在重庆和北京开展仿制药质量和疗效一致性评价生物等效性试验培训，由此可见BE是一致性评价的关键和核心内容。

　　在生物等效性试验中样本量的估算极其关键，同时也是难点，如果纳入的受试者例数不足，可能无法得到确定的结论(统计学上认为把握度不够);如果纳入过多的受试者，不仅增加了试验的财力、人力、时间成本，而且还存在伦理学问题，因为生物等效试验多为健康受试者，一般不能直接从生物等效试验中受益，过多的受试者暴露于试验药物/参比制剂，增加了安全风险。因此，对于生物等效性试验，如何确定合适数量的受试者极为关键，由于大多数生物等效性研究推荐使用平均生物等效性(refer-ence-scaled average bioequivalence，ＲSABE)方法，本文参考相关文献资料，对仿制药人体平均生物等效性试验样本量的相关问题进行探讨。

　　我国食品药品监督管理局2005年颁布的《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》［4］中要求:“受试者例数应当符合统计学要求，对于目前的统计方法，18～24例可满足大多数药物对样本量的要求，但对某些变异性大的药物可能需要适当增加例数”。2015版《中华人民共和国药典》、《药物制剂生物利用度和生物等效性指导原则》(草案)［5］指出:“在一项生物等效性试验中，可评价的受试者数目不应少于18名”。CFDA 2016年《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》指出入选受试者的例数应使生物等效性评价具有足够的统计学效力。美国2003年在“Guidance for industry，bioavail-ability andbioequivalence studies for orally adminis-tered drug products-general considerations”中建议:受试者的总数应提供足够的把握度获得生物等效的结论［6］。欧盟2010年在“Guideline on the investigation ofbioequivalence”要求:纳入受试者例数应基于合适的样本量计算，可评价的受试者例数不少于12例［7］。日本2012年在仿制药生物等效性研究的指导原则中指出:应纳入足够受试者进行生物等效性评价;如受试者例数不足而不能获得生物等效的结论，可追加受试者，追加受试者的例数不应少于原试验例数的一半［8］。从以上例举的国内外法规对于样本量的描述可以看出，尽管对最低样本量的要求不尽相同，但均强调了样本量应符合统计学要求。

　　2．1试验设计的类型  试验设计是确定样本量的前提，生物等效性试验一般采用交叉设计，除非有确实的科学依据表明平行设计(如长半衰期药物可以采用平行设计)或其他设计更为合适。交叉设计分为2制剂2周期交叉设计、2制剂3周期交叉设计和2制剂4周期交叉设计。

　　2．2生物等效的判定标准  目前美国、中国、欧盟等主要国家和地区，生物等效接受标准:受试制剂与参比制剂的AUC0～t，AUC0～∞，Cmax的几何均数比值(geometric mean ratio，GMＲ)的90%置信区间(90%CI)在80．00%～125．00%。对于窄治疗窗药物，应根据药物的特性适当缩小90%CI范围，可取90.00%～111.11%［6］。对于高变异药品AUC和/或Cmax，可放宽判断标准，但要有充足理由，并在试验方案中事先规定［6－7］。

　　2．3显著性水平及把握度  显著性水平即α值的大小，通常取0．05。把握度也称检验效能，一般不小于80%(1-β)，α代表发生第Ⅰ类错误概率，第Ⅰ类错误是将不具有生物等效性的制剂错误地判断为具有生物等效性的制剂，也称为患者风险。β代表发生第Ⅱ类错误的概率，通常≤20%，第Ⅱ类错误是将具有生物等效性的制剂错误地判断为不具有生物等效性的制剂，也称为生产商风险。

　　2．4变异系数  在经典的2×2交叉设计的生物等效性试验中，经自然对数转换的AUC和Cmax进行4因素方差分析(4因素包括药物剂型、给药周期、给药顺序和嵌套在给药顺序内的受试者个体因素)，得到残差(mean square error，MSE)，个体内变异系数(intra-subject CV，intra CV)intra CV=(exp(MSE)-1)^0．5［9］;在平行设计的生物等效性Inter-subject CV=(exp(Var(subj(seq)))^0．5。

2．5差别  差别通常以θ表示，θ=μT－μＲ，μT和μＲ分别为受试制剂与参比制剂参数的总体均值。生物等效性试验中，θ是指受试制剂与参比制剂药动学参数的几何均数的比值，即θ=μT/μＲ以GMＲ表示，对于普通药物，GMＲ一般取0．95(或1．05)，差异较大时可以取 0． 9( 或 1． 1) 。

　　3．1预BE试验的目的  ①确认制剂处方有无太大差异。②优化样品收集时间间隔，清除期(洗脱期)的时间是否足够，药动学曲线是否能够完整表现吸收、分布、代谢、排除。③生物样品的分析方法学是否恰当，例如:线性范围是否合适，代谢产物的分析方法是否合适。④试验药物在受试者中的变异性:以预BE试验的药动学参数结果进行正式试验的样本量估算，确定样本量大小以获得足够的成功机率。

　　3．2预BE试验的适用范围  对于一些仿制药，为了规避处方工艺专利，或者更换了辅料，或者采用的工艺不同等原因导致仿制药的处方工艺和原研药不一致，尤其是缓控释产品，通常需要做预BE试验。同时对复杂剂型和BCS 2类几乎必做预BE试验，当然也可直接做BE试验，但失败可能性很大。预BE试验在美国仿制药公司是常态，未来在国内也应成“新常态”。但并不是说所有的药都需要做预BE试验，比如BCSⅠ类或Ⅲ类的速释药物，预BE试验就没有太大的必要。

　　3．3预BE试验的例数  目前预BE试验的受试者例数没有统一规定，通常采用8～12例，如果变异系数大的，可以做18例，对于变异系数特别大的，甚至有预试验做到24例。

　　3．4预BE试验的设计类型  预BE试验主要是确认2制剂在体内的变异系数，所以要执行交叉设计才能取得体内intra CV，平行试验设计预测结果所获得的变异性数据只是个体间的inter CV，无法确定制剂处方差异还是其他差异造成的吸收差异。

　　3．5预BE试验餐前餐后区别  一般情况下，空腹试验更容易探查制剂间差异，将非制剂因素引起的变异最小化。餐后试验考察最大影响下制剂是否等效。

　　样本量的计算有查表法、公式法和软件法，所得结果基本一致，但需要注明计算公式、表格出处或软件的类型及版本号。

　　公式法:在显著性水平α达到(1-β)把握度所需的受试者例数计算如公式1［10］，n为每个序列受试者的例数;两周期交叉试验所需总受试者例数N=2n;σ2是残差方差，与所需例数成正相关;θ是制剂T和Ｒ比值，θ越偏离1，所需例数越多;δ是BE接受标准，一般取值ln 0．80或ln 1．25。

　　当θ=1时，n≥［t(α，2n－2)+t(β，2n－2)］2(σ2W/ln 1．25)2;当1＜θ＜1．25时，n≥［t(α，2n－2)+t(β，2n－2)］2［σ2W/(ln1．25－lnθ)］2;当0．8＜θ＜1时，n≥［t(α，2n－2)+t(β，2n－2)］2［σ2W/(lnθ－ln0．8)］2 。   公式1

　　查表法:在α=0．05，相同的CV时，要达到较高的把握度，所需要的受试者的例数越多，因此要达到80%和90%的把握度，所需受试者例数N也有区别(见表1)。

　　软件法:PASS，nQuery，S+和SAS等软件都可以计算生物等效性试验的样本量。

　　样本含量估计以药动学参数的变异系数为计算指标，α=0．05，1－β=0．8，GMＲ=0．95，等效标准为80．00%～125．00%，双交叉设计试验的计算过程见图1。

　　软件法和查表法的比较:可以看出，当变异系数为0．25，θ=0．95，α=0．05，把握度为80%时，软件法和查表法计算结果均为28例，结果一致。

　　对于高变异药品(变异系数＞30%)，可进行半重复或全重复、参比制剂校正的平均生物等效性试验，样本量估计可参考相关文献［10］，FDA推荐平均生物等效性研究不少于24例，值得注意的是，计算结果为纳入生物等效性评价的样本量，同时应考虑到试验中受试者脱落的可能性，一般需要根据脱落率适当增加一些受试者入组试验。

　　对于窄治疗指数药物，可进行全重复、参比制剂校正的平均生物等效性试验。2015年《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》中指出:对于治疗指数窄的药品的特殊情况，AUC的可接受区间应该被缩窄为90．00%～111．11%。2010年4月以后，FDA规定当参比制剂个体内变异系数＞21%时，受试制剂与参比制剂药动学参数(AUC，Cmax)的几何均数比值的90%CI不超过80.00%～125.00%，如利伐沙班;当参比制剂个体内变异系数＜21%时，应根据参比制剂个体内变异系数的大小，成比例地缩窄90%CI，如华法林、氨茶碱、卡马西平、环孢素、地高辛，90%CI则为90.00%～111.11%。

　　样本量的大小与GMＲ的(1－2α)置信区间(一般为90%CI)成负相关［11］，一项生物等效性试验因样本量不同可能产生以下4种试验结果［12］:①样本量足够，GMＲ的(1－2α)置信区间(一般为90%CI)完全落在规定的范围内(一般为80．00%～125．00%)，结果为可以判断为生物等效。②样本量足够，GMＲ的(1－2α)置信区间完全不在规定的范围内，结果为可以判断为生物不等效。③样本量不足，GMＲ的(1－2α)置信区间大部分在规定的范围内，结果为不能判断为生物等效，可能犯二类错误，即将等效的试 验 药 判 为 不 等 效。④ 样 本 量 不 足，GMＲ 的( 1 － 2α) 置信区间大部分不在规定的范围内，结果为不能判断为生物不等效。见图 2。

　　应根据具体情况，分析并决定试验的成败，或者受试制剂的取舍或改进。

　　总体而言，生物等效性试验样本量的最终确定，需要根据国内外的指导原则和相关文献报道或既往研究结果，结合试验经验来进行估算。具体为:①要根据试验设计类型、生物等效判断标准和相关统计学要求，采用合适的方法确定样本量，无法得到相关报道的药物，最好开展预试验，根据预试验的结果来估算样本量。②2×2交叉设计的生物等效性试验的可评价受试者不应少于12例，高变异药品半重复或全重复、参比制剂校正的生物等效性试验的可评价受试者一般不应少于24例［13］，考虑到受试者脱落等因素，应筛选合适的受试者入组试验。③受试者的剔除和追加必须有充分理由，并在试验方案或相关标准操作规程中事先明确。④不建议轻易改变试验设计类型，例如预BE执行交叉试验，预估交叉试验受试者例数 n，正式试验改为平行 2n例，结果失败的可能性会加大。