【好文推荐】嗜热S-腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化及S-腺苷甲硫氨酸的制备

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嗜热S-腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化及S-腺苷甲硫氨酸的制备

Immobilization of Thermophilic S-Adenosylmethionine Synthetase and Preparation of S-Adenosylmethionine

化浩举1，吴 勇1，黄宗庆1，张喜全2，冯 军1*

(1. 上海多米瑞生物技术有限公司，上海 201203；2. 正大天晴药业集团股份有限公司，江苏南京 210000)

S- 腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM，2) 是生物体中重要的代谢中间体，参与了生物体内40 多种代谢过程[1]。2 在临床上可用于肝脏损伤、关节炎、抑郁症和胆汁淤积的治疗，同时还可以作为保健品用来预防癌症和减缓衰老[2—3]。我国肝病患者众多，2 具有非常好的销售前景。目前2的工业化生产方法主要是酵母菌发酵法，该方法存在发酵操作体积大、杂质含量高和纯化步骤多等缺点，同时伴有废水产生多和环保压力大的问题[4]。近年来酶促转化法生产2 成为研究热点，主要利用S- 腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl methionine synthetase，1)催化L- 甲硫氨酸(L-methionine，L-Met) 与三磷酸腺苷(adenylate triphosphate，ATP) 完成，但由于游离酶催化存在产物不易分离和酶难以回收等问题，因此采用固定化酶法是较好的选择[5]。

本研究采用来源于古菌属詹式甲烷球菌(Methanococcus jannaschii) 的1 进行固定化研究，该酶具有活性高和热稳定性好的优点，方便操作[6]。

1 仪器与试药

2 方法与结果

2.1 酶活力的测定

2.2 1 浓缩液的制备

2.3 固定化酶活力的测定

2.4 2 种树脂共价固定化1 的比较

2.5 2 种固定化酶连续反应稳定性的比较

2.6 固定化酶装柱反应条件的优化

2.7 2 的纯化

3 讨论

关于酶的固定化目前没有统一适用的理论和方法。已报道的1 的固定化方法均存在一些问题，使用Ni 离子螯合柱固定化1，不仅树脂价格昂贵，而且3 次连续反应后固定化酶活力回收率仅剩39.5％ [8]。尹春丽等通过海藻酸钠和明胶包埋法、壳聚糖与戊二醛交联法得到的固定化1 存在机械强度低、重复使用过程中容易破碎以及固定后反应时间过长等问题[9—10]。卢泓宇等通过离子交换树脂键合法得到固定化1，不仅反应时间长，而且不能耐受高离子浓度，难以在工业生产中应用[11]。氨基树脂成本低、固定化后的酶比活力和酶活力回收率较高，连续反应稳定性好且机械强度高，具有明显的优势。

本研究使用重组大肠杆菌表达1，并利用1 的耐热特性，采用高温水浴的方法直接获得了电泳纯度较高的1 液，利用戊二醛交联法实现了氨基树脂对1 的固定化，固定化酶连续反应8 次后相对酶活力仍在80％以上。2 极不稳定，在常规酶促反应条件下制备2 时，若周期较长容易产生降解和氧化杂质，增加纯化难度且难以保证较高的纯化收率[12]。本研究进一步探讨固定化酶装柱反应的条件，优化2 的纯化方法，得到了柱上操作方便、时间短(20 min) 且产物2 摩尔转化率高的反应条件。后续2 的反应液直接上样DK-1 树脂柱进行纯化，方法简单，纯度和收率高，具有较好的工业化前景。

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