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达托霉素的分离纯化工艺
Separation and Purification Process of Daptomycin
郭朝江，王 蒙，刘 忠，李春利，张贵民*
(鲁南制药股份有限公司，山东临沂 273400)
摘要：联合应用反相色谱树脂和离子交换树脂分离纯化达托霉素，比较各树脂的载样量、累积洗脱回收率和纯化倍数确定树脂型号。依次采用LP20MM 反相色谱树脂、NM-Q 离子交换树脂和XT-30 反相色谱树脂进行分离纯化，纯化工艺参数：将粗分离发酵液上样于LP20MM 反相色谱树脂柱，用10％乙腈溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于80％的洗脱液，上样于NM-Q 离子交换树脂柱，用10 g/L 氯化钠溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于90％的洗脱液，上样于XT-30 反相色谱树脂柱，用50％乙醇( 含乙酸铵40 mmol/L) 溶液洗脱，收集达托霉素纯度大于99％的洗脱液，经纯化后达托霉素的纯度达到99.3％，纯化收率为57.5％。
关键词：达托霉素；分离；纯化；反相色谱树脂；离子交换树脂
达托霉素(daptomycin，1) 是自玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus) 发酵液中提取得到的一种环酯肽类抗生素[1]。1 具有新颖的化学结构，能在多个方面破坏细菌细胞膜的功能，迅速杀死革兰阳性菌[2]。1 在临床上表现出广谱、药效快、给药量小和不良反应少等优点，被批准用于治疗革兰阳性菌引起的复杂性皮肤和皮肤结构感染，以及由金黄色葡萄球菌引起的菌血症及右路心内膜炎症[3]。此外，1 在体外对耐甲氧西林和利奈唑胺的菌株仍具有较强活力[4]。
1 的分子结构中含有4 个侧链羧酸(3 个门冬氨酸和1 个甲基谷氨酸)，这些残基的pKa 值为3 ～ 6，1 的结构中又含有脂链和疏水性氨基酸，决定了1具有两亲性的生物学特性。1 在pH=pI 条件下呈中性分子，在其他pH 值下呈不同的活性状态[5]。本研究根据1 的特性联合应用反相色谱法和离子交换色谱法分离纯化1，确定了最佳树脂型号和工艺参数，为制备高纯度的1 提供技术参考。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.2 溶液配制
2.3 反相色谱树脂( Ⅰ ) 的分离纯化
2.3.1 反相色谱树脂( Ⅰ ) 载样量的考察
2.3.2 反相色谱树脂( Ⅰ ) 累积洗脱回收率的考察
2.4 离子交换树脂的分离纯化
2.4.1 离子交换树脂载样量的考察
2.4.2 离子交换树脂累积洗脱回收率的考察
2.5 反相色谱树脂( Ⅱ ) 的分离纯化
2.5.1 反相色谱树脂( Ⅱ ) 载样量的考察
2.5.2 反相色谱树脂( Ⅱ ) 累积洗脱回收率的考察
2.6 试验结果的验证
3 讨论
目前国外专利报道的1 分离纯化方法主要是采用丁醇浸提或交替使用阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱进行反复纯化，这些方法操作复杂且生产成本高[6]。国内报道的1 分离纯化方法主要采用阴离子和C4 反相硅胶复合物作为复合型反相硅胶柱进行纯化，或采用阴离子树脂进行纯化，均取得了一定的纯化效果，但所得1 的纯度较低[7—8]。
本研究确定了1 的分离纯化工艺：依次采用LP20MM 反相色谱树脂、NM-Q 离子交换树脂和XT-30 反相色谱树脂进行分离纯化。最佳工艺参数为：LP20MM 反相色谱树脂柱，上样液pH 7.0，流速为0.8 BV/h，用pH 7.0 的10％乙腈溶液以0.8 BV/h 的流速洗脱；NM-Q 离子交换树脂柱，上样液pH 7.5，流速为1 BV/h，用10 g/L 的氯化钠溶液以1 BV/h 的流速洗脱；XT-30 反相色谱树脂柱，上样液pH 4.8，流速0.5 BV/h，用pH 4.0 的50％乙醇溶液( 含乙酸铵40mmol/L) 以0.5 BV/h 的流速洗脱。经过3 步分离纯化工序，1 的纯度达到99.3％，纯化总回收率为57.5％。该纯化工艺操作流程简单，洗脱质量好，显著提高了1 的纯度，为制备高纯度的1 提供参考。
作者简介：郭朝江(1976—)，男，高级工程师，从事生物药的研究与开发。
E-mail：guo_cj777@sina.com
通信联系人：张贵民(1969—)，男，研究员，从事药物的研究与开发。
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