眼科药物非临床研究的考虑

Non-clinical study of ophthalmic drugs

中南药学，2018 年10 月 第16 卷 第10 期

戴学栋，尹华静，王庆利，胡晓敏

国家药品监督管理局药品审评中心

眼部独特的解剖生理结构给眼科药物开发带来了很多挑战。目前国内外均未有针对眼科药物非临床研究的指导原则。本文结合审评实例，介绍了眼科药物非临床研究设计的考虑，为研发提供参考。

眼是我们通向世界的窗户，随着世界人口老龄化程度的提高、生活方式的改变，白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性（AMD）、糖尿病视网膜病变（DR）、糖尿病性黄斑水肿（DME）、视网膜静脉阻塞（RVO）、干眼病及过敏性结膜炎等眼科疾病，发病率逐年上升，预计2020 年全球患病人数将达1 亿9 千万人[1]。

在当前全球人口老龄化不断加剧的背景下，这些“定时炸弹”不仅影响个人的身体健康和生活质量，还给家庭和社会带来了严重的经济负担，已成为重大公共卫生问题和社会问题。随着基因组学、分子生物学、细胞生物学、材料科学、影像学等基础科学的不断发展，人们对眼科疾病发病机制认识的不断深入，眼科治疗药物研发取得了突破性的进展。全球药物市场分析数据显示，眼科药物市场增长约是医药行业整体增长速度的2.5 倍。越来越多的新创企业和生物公司加入到眼科药物研发行列，眼科药物开发正面临前所未有的机遇。

但眼是一个十分复杂的器官，有着特殊的解剖生理结构和屏障系统，外源药物很难进入眼内靶组织发挥疗效，这给眼科药物开发带来了挑战。

1.1　眼解剖结构

眼由眼球壁和内容物构成。眼球壁由三层组织构成，外层为纤维膜（包括眼前部透明的角膜、后部白色的巩膜及中间起连接作用的角膜缘），中层为葡萄膜（由虹膜、睫状体和脉络膜组成），内层为视网膜。

眼内容物包括房水、晶状体和玻璃体，与角膜一起构成眼的屈光系统。其中晶状体是眼内重要的透明实体组织，它位于虹膜后、玻璃体前，被晶状体悬韧带固定于睫状体之间。晶状体之前的眼结构称为眼前段，约占眼球的1/3，由角膜、结膜、虹膜、睫状体、晶状体和房水组成；晶状体之后的眼结构为眼后段，约占眼球的2/3，由巩膜、脉络膜、视网膜及充满玻璃体液的玻璃体组成[2-3]。

1.2　眼屏障系统

眼独特的屏障系统，可选择性的控制内、外源性物质的通透性，具有维持眼内环境平衡的作用。

眼屏障系统分为静态屏障和动态屏障。静态屏障包括：角膜屏障、血- 房水屏障（BAB）、血- 视网膜屏障（BRB）， 一般将BAB 和BRB 统称为血- 眼屏障（BOB）。

角膜屏障包括亲脂性的角膜上皮和亲水性的基质，其中基质层约占角膜厚度的90%，角膜这种结构可有效阻止眼局部外用药物进入前房。

BAB 主要由睫状体非色素上皮细胞层和虹膜血管内皮层的紧密连接组成，BAB 限制了水溶性分子通过虹膜毛细血管向房水转运。BRB 分为视网膜内屏障和视网膜外屏障，内屏障是指视网膜毛细血管内皮细胞间的紧密连接，外屏障是指视网膜色素上皮细胞间的紧密连接。

全身暴露的药物必须跨过视网膜屏障才能进入眼内。动态屏障包括结膜和脉络膜的血液/ 淋巴液循环，泪液、房水的引流和周转等，这是局部外用药物眼内生物利用度低的重要原因之一。

此外，眼组织毛细血管内皮细胞表达的外排转运体，如P- 糖蛋白、多耐药蛋白、乳腺癌耐药蛋白等，对药物吸收也是一种重要屏障。

1.3　眼科药物常见给药途径

眼部给药途径大致可分为三类：局部给药（滴眼液、眼膏、眼凝胶等）、眼内（玻璃体腔注射及前房注射等）或植入给药、眼周给药（结膜下、球后、球周、筋膜下给药等）。

用于治疗眼前段疾病的药物常采用局部给药途径，治疗眼后段疾病的药物常采用眼内/ 眼周注射或植入给药途径。

1.3.1　局部给药　

局部给药患者用药方便，可选择性的将药物递送到眼前段组织中，是目前眼科药物的主要给药途径。

角膜前泪液体积仅7 ～ 10 μL，且泪液每2 ～ 3 min 周转一次，因此滴眼液常采用下结膜囊给药[2]。

结膜囊最大体积约为30 μL，由于眨眼等生理反应，大部分药物会通过鼻泪管或面颊排出。

由于眼的静态屏障和动态屏障，最终仅有1% ～ 7% 的药物进入房水中。

药物一旦进入房水，可很快分布到虹膜和睫状体中[3]，进入房水的少量药物很难再进入眼后段组织中达到有效的治疗浓度，因此眼后段疾病治疗药物一般不采用局部给药途径。

1.3.2　玻璃体腔注射　

玻璃体腔给药可将溶液、混悬液等直接注射进入玻璃体腔中，药物可直接与视网膜接触。

玻璃体腔注射药物，一般需几个小时才能扩散分布至整个玻璃体腔。进入玻璃体的药物同时也可扩散到眼前段组织或跨过视网膜内屏障进入视网膜毛细血管中消除[3]。

受视网膜色素上皮细胞紧密连接的阻碍，药物从玻璃体腔转运到脉络膜的速度很慢。影响玻璃体腔中药物暴露的因素包括给药剂量、分布容积和消除速率。

玻璃体腔中药物的清除速率主要和药物分子量有关，小分子药物相对大分子药物清除速率更快。

与眼周给药途径相比，玻璃体腔注射可获得更高的玻璃体/ 视网膜/  脉络膜药物浓度，适用于眼底疾病治疗药物。

但这种给药方式会带来严重的不良反应，如眼内炎症、晶状体浑浊、视网膜脱落、视网膜出血等[4]。

1.3.3　眼周给药[3-4]　

眼周给药包括结膜下、球后、球周及筋膜下等给药途径，靠近巩膜部位。巩膜是由胶原纤维构成的纤维组织，药物通透性较高。经眼周给药，药物可穿过巩膜，在视网膜和玻璃体腔中达到较高的药物浓度，这是眼后段组织给药最常采用的给药方式。

结膜下给药：

结膜是一种薄而半透明的黏液分泌组织，与角膜相连，覆盖在巩膜上方，在结膜和巩膜之间的空隙即为结膜下。结膜下给药一次可给予大约500 μL。

筋膜下给药：

可将药物直接注射于筋膜囊和巩膜之间的间隙中，一次最大可注射4 mL，常用于眼科手术时的麻醉剂给药，常见的不良反应包括结膜下出血、结膜肿胀及眼部疼痛。

球周给药：

在上下直肌和内外直肌外侧给药，根据注射部位又分为前或后球周注射，一般用于白内障手术时的麻醉药物给药，一次可注射8 ～ 10 mL。

球后给药：

一种直接穿过眼睑和眶筋膜将药物注射入上下直肌和内外直肌的肌间隙，主要用于麻醉药物，这种给药方式有损伤视神经的风险。

相比其他组织或器官，眼结构小而精细，且存在屏障系统，药物难以进入眼内发挥疗效，这给眼科药物非临床研究带来挑战。目前国内尚未有针对眼科药物非临床研究的指导原则。

通过查阅文献，结合审评实例，介绍眼科药物非临床研究设计的考虑，以供研发参考。

2.1　非临床有效性研究

2.1.1　一般考虑　

由于动物和人存在种属差异，任何动物模型都不可能完全模拟药物在人体中的作用，建议采用多种模型组合验证药物的疗效。眼部用药药效学试验关键是选择合适的动物模型和药效学指标，证明药物在靶组织中达到有效治疗浓度。

动物模型应关注与人体的相关性和局限性[5-6]，包括：

① 动物眼部解剖和生理结构与人的相似性和差异性；

② 与人疾病的病理生理学的相似性和差异性，包括发病机制、疾病进程和临床表现等方面；

③ 药物与人和动物靶点结合或占位的差异；

④ 药物在动物和人体药代动力学方面的差异，如蛋白结合率、黑色素结合率差异等。

选择的药效学指标应能够较好地测定及预测药物的疗效，尽量涵盖一些临床试验不能监测的指标，如病理学指标等。

2.1.2　案例　

Aflibercept（阿柏西普注射液，商品名：艾力雅®/Eylea®）：Bayer 公司研发的人血管内皮生长因子（VEGF）受体融合蛋白，于2011 年在美国上市，玻璃体腔注射用于治疗AMD、DME、DR、RVO 等眼底血管疾病。

体外药效学试验测定了Aflibercept 与不同种属（人、大鼠、小鼠、兔）VEGF-A 的亲和力，采用人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）检测Aflibercept对VEGF 受体信号的阻断作用，Aflibercept 对VEGF诱导的HUVECs 增殖的抑制作用。

体内试验采用多种视血管疾病模型评估Aflibercept 抑制血管异常通透或新生血管形成的能力，如用激光诱导的啮齿类和猴脉络膜新生血管（CNV）模型；在野生型小鼠（注射给予VEGF）或过表达hVEGF 的转基因小鼠中评估Aflibercept 对VEGF 诱导的视网膜屏障损伤的保护作用；在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠视网膜水肿模型中和高压氧诱导的小鼠缺血性视网膜病变模型中评Aflibercept 对视网膜水肿和新生血管的改善作用。

终点指标包括眼底照相、荧光素血管造影、组织病理学检查等。

2.2　药代动力学试验

新药开发过程中一般都需要开展吸收（A）、分布（D）、代谢（M）和排泄（E）研究。

人眼内有多种屏障，药物很难穿过屏障达到靶组织。与一般药物不同，眼组织中的药物分布与系统暴露无直接关系，眼科药物不仅要研究药物在全身ADME 情况，更应关注药物在眼组织中的分布，包括眼靶组织中药物浓度- 时间关系，为眼局部给药后的有效性和安全性评价提供支持性数据。

眼组织中存在较高水平的酯酶，少量的CYP450 酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶及其他一些Ⅱ相代谢酶，角膜中存在较高水平的醛脱氢酶[7]，因此应关注药物（尤其是一些前体药物）在眼组织中的代谢情况。

此外，眼葡萄膜和视网膜组织中含有黑色素，黑色素含有多个羟基和羧基位点，可与药物（尤其是碱性药物，如麻黄碱、阿托品、左氧氟沙星等）结合。

药物一旦与黑色素结合会形成一个药物储存库，缓慢释放到周围组织中，进而影响药物的药代动力学、有效性和安全性，建议小分子药物研发早期开展黑色素的体外结合研究[6-7]。

新药开发过程中一般都要开展人体药代动力学研究，但对于眼科药物，连续从人体眼组织采集样品进行生物分析，既不符合伦理也不可行，常采用动物眼组织分布研究来外推或替代人眼药代动力学研究[2-3，8]。

兔、猴和人具有相似的眼解剖结构，是眼药代动力学研究最常采用的动物。由于兔易获得、成本低，小分子药物常采用兔开展药代动力学研究；大分子药物受免疫原性及严重炎症反应影响，常采用猴开展药代动力学研究[8-9]。

Rhopressa（netarsudil 0.02% 滴眼液），是Aerie 公司研发的一种用于降低开角型青光眼或高眼压患者眼内压的新型小分子药物，2017 年12 月获FDA 批准上市。

Rhopressa 每日一次滴眼给药，可调控房水外流，从而降低巩膜静脉压。Rhopressa 进行的药代动力学研究有：体外黑色素结合研究和血浆蛋白结合研究，有色兔滴眼给药眼组织分布和全身组织分布研究（放射性同位素标记法），大鼠静脉给药物质平衡研究和全身放射自显影分布研究，兔滴眼给药房水药物浓度- 时间曲线研究。

Aflibercept 开展的药代动力学研究有：

① 有色兔和食蟹猴玻璃体注射给药的组织分布研究，包括脉络膜、视网膜、玻璃体和血浆中药物浓度- 时间曲线研究；

②大鼠静脉给药后的全身组织分布研究（同位素标记）；

③ 小鼠、大鼠和食蟹猴中静脉给药和皮下给药后血清药物浓度- 时间曲线研究。

2.2.1　眼组织生物样品的采集和处理[10]　

眼由多种异质性的组织和液体组成，在进行眼组织药代动力学研

究时，需要对各组织/ 液体进行精细分离。

按照结构组成和样品后续处理程序的不同分为：

① 泪液，主要由蛋白、脂质、碳水化合物和电解质组成，可采用泪液检测滤纸条采集；

② 房水，和血浆超滤液电解质浓度基本相似，但房水中蛋白含量很低，约是血浆蛋白浓度的0.5%，样品处理方法相对简单；

③ 玻璃体液，主要由水组成，但含有胶原蛋白、透明质酸及其他蛋白聚糖，这使玻璃体液具有凝胶样性质，药物在玻璃体液中不均匀分布，因此应将全部玻璃体液混匀后再取样分析；

④ 角膜、巩膜和晶状体组织含有胶原蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，难以匀浆，需要更长或更多的匀浆处理操作；

⑤ 虹膜、睫状体、脉络膜和视网膜组织中存在黑色素，若药物与黑色素结合，可能会影响药物的检出，样品处理和分析时应考虑黑色素结合对检测结果的影响。

动物安乐死后，眼组织中的生物屏障会迅速破坏，药物会在整个眼组织中迅速达到平衡。眼组织中的酯酶在离体条件下也有一定的活性。因此处理动物后，应迅速摘取眼球并立即放入液氮或干冰中保存，以防止药物转移到邻近组织中或被代谢消除，解剖分离眼组织时也应全程在冷冻状态下完成。

2.2.2　替代基质的使用　

在进行生物分析时，一般采用与待测样品相同的生物基质建立标准曲线。在对眼组织样品进行生物分析时，由于眼组织样本较小，不可能剖杀大量动物来获得对照基质，可采用与眼组织样品高度相似的替代基质。

若无法获得高度相近的替代基质，也可采用略微相近的替代基质（如血浆），这时一般需用内部标准品（当使用LC-MS/MS 法时）进行校正，样品处理方法应与待测样品的处理方法一致。

对于存在黑色素的组织，若采用含有黑色素的组织建立标准曲线，只要在测定浓度范围内，药物与替代基质黑色素的结合程度与待测基质中黑色素结合程度相似，对测定结果影响不大；若采用无黑色素的组织作为替代基质建立标准曲线，受内源性黑色素的影响，替代基质中的药物响应值可能与待测样品中不同，这时需用内部标准品来进行校正。

3.1　一般考虑

与常规药物的非临床开发策略相似，眼科药物应按照ICH M3（R2）Nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals 和ICH S6 Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals 的要求分阶段开展支持临床试验或上市的非临床安全性试验。

对于眼局部给药的药物，一般需要临床拟用给药途径和全身给药途径的重复给药毒性试验。

全身重复给药毒性试验是为了提高药物系统暴露水平，发现眼以外的毒性靶器官/ 毒性反应，一般采用两种相关动物静脉给药28 d（除非有特殊的安全性担忧），观察指标同常规的重复给药毒性试验。

眼局部给药的重复给药毒性试验常用兔和猴，除常规观察指标外，还包括更详细和系统的眼科检查和眼组织病理学检查（包括眼内组织和眼周组织）。眼表局部给药最大体积约为30 μL，玻璃体注射最大给药体积为100 μL，给药体积

过大可能会导致临床不相关的毒性出现；为最大程度暴露眼毒性，一般采用双眼同时给药并提高给药频率。

即使临床拟用途径下无明显的全身暴露，仍需在两种相关动物种属中开展胚胎- 胎仔发育毒性试验，推荐采用全身给药途径。根据眼局部重复给药毒性试验结果、胚胎- 胎仔发育毒性试验结果以及全身暴露的安全范围，可能还需要追加其他生殖毒性试验，如大鼠生育力和早期胚胎发育毒性试验和围产期发育毒性试验。

3.2　眼科检查

眼科药物毒性研究需要同时考察全身毒性和眼局部毒性。由于眼具有透明性，眼科检查可直接在活体动物中反复观察眼内结构，可与病理学指标相结合综合评估眼局部毒性。

根据所用动物种属和研究目的不同，所开展的眼科检查项目也有所不同。常规眼科检查应至少包括眼附属结构（眼睑和结膜）、眼前段（角膜、前房、虹膜和玻璃体等）和眼后段（玻璃体、视网膜等）检查，一般采用裂隙灯生物显微镜检查和间接/直接检验镜检查。

系统的眼科检查包括但不限于角膜荧光素钠染色、角膜厚度测量、眼压测定、眼底照相、荧光素血管造影、视觉系统电生理检查（视觉诱发动作电位、视网膜电图）和光学相干断层扫描（OCT）等，这些检查方法联合使用可提供更完整、更全面的信息。

3.3　案例

Rhopressa（滴眼液）开展的非临床安全性的研究有：

① 安全药理学方面：体外hERG 试验，在清醒遥测犬中进行的静脉给药的安全药理学试验；

② 重复给药毒性试验：评估了Rhopressa 的全身毒性和眼局部毒性，包括大鼠和犬的7、28 d 重复静脉给药毒性试验，兔（1、3 和6 个月）和猴（1 和9 个月）重复滴眼给药毒性试验；

③ 标准组合的遗传毒性试验；

④ 大鼠和兔静脉给药的胚胎- 胎仔发育毒性试验（虽然临床拟用途径下无明显的全身暴露）。

在重复给药毒性试验中开展的眼科检查包括：角膜荧光素染色＋裂隙灯显微镜检查、间接检验镜检查、眼压测定和视网膜电图检查。

组织病理学检查除常规组织检查外，还对眼组织进行了详细的病理学检查。

Aflibercept 开展的非临床安全性试验包括：

① 清醒大鼠静脉给药对呼吸系统功能影响的研究，清醒猴静脉给药后对循环系统功能的影响研究（结合在重复给药毒性试验中）；

② 猴单次玻璃体注射和大鼠单次静脉给药毒性试验；

③ 重复给药毒性试验：包括猴13周和8 个月玻璃体注射给药试验，猴4 周、13 周和6个月静脉给药毒性试验；猴4 周和13 周皮下给药毒性试验，大鼠13 周皮下给药毒性试验；

④ 生殖毒性试验：静脉注射和皮下注射的兔胚胎- 胎仔发育毒性试验；

⑤局部耐受性试验：猴玻璃体注射及兔全身给药（静脉、皮下和肌内注射）局部耐受性试验；

⑥ 组织交叉反应试验、免疫原性试验，及在幼龄猴13 周的重复静脉给药毒性试验中评估对骨骼发育的影响。

重复给药毒性试验中进行的眼科检查项目包括：裂隙灯显微镜检查、间接检验镜检查、眼压测定、眼底照相、荧光素血管造影及视网膜电图检查等。组织病理学检查除常规组织检查外，还对眼组织进行了详细的病理学检查。

眼具有的特殊的解剖生理结构和屏障系统，使外源药物很难进入眼内。不同给药途径下，药物在眼内的药代动力学特征和风险也各不相同。

因此，眼科新药非临床研究也不同于其他药物，药效、药代动力学方面需证明药物可在靶组织中达到有效治疗浓度，安全性方面需同时考察全身毒性和眼局部毒性。对于眼科新药，应根据拟定适应证、用药人群、给药途径、给药期限、给药频率，按照“Case-by-Case”及“基于风险”的原则分阶段的开展相应的非临床研究，为拟开展的临床试验或上市提供支持性数据。

详见原文：

中南药学，2018 年10 月 第16 卷 第10 期

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